鞍帶石斑魚isg15 基因cDNA 克隆及其在虹彩病毒感染下的表達分析

馬 騰 王 磊 趙玉柱 吳垚磊 周 茜 陳張帆 朱春華 陳松林

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 山東 青島 266071；2. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；3. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江)廣東省名特優魚類生殖調控與繁育技術工程中心 廣東海洋大學 廣東 湛江 524088)

干擾素(interferons, IFNs)是一種在脊椎動物的抗病毒防御(Cocciaet al, 2015; Skauget al, 2010)、免疫激活(Linet al, 2014; Blomstromet al, 1986)和細胞增長調節(Lenschowet al, 2007; Cunhaet al, 1996)過程中起著重要作用的細胞因子(Yooet al, 2014; Zhaoet al, 2005)。目前，已知的I 型和Ⅱ型ifn基因在魚類對病毒感染的先天免疫和適應性免疫中起關鍵的抗病毒防御作用(Zouet al, 2011; Liuet al, 2010; Baecket al, 2008)。被病毒感染的細胞識別病毒的dsRNA，且觸發 IFNs 基因與其同源受體結合，進而啟動JAK/STAT 信號聯系，導致干擾素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)的轉錄誘導過程(Robertsenet al, 2006; Liuet al, 2002; Loebet al, 1992)。干擾素刺激基因是先天免疫系統的主要部分，對限制細胞內和細胞間的病毒復制和傳播非常重要，ISGs 的作用機制對靶向目標有效的抗病毒感染起著至關重要的作 用(Hubelet al, 2019; Yasuikeet al, 2011;Giannakopouloset al, 2009)。ISG15 是一種可以作用于細胞內的抗病毒蛋白(Danielet al, 2017; Ozatoet al,2008)，它可以通過病毒與細胞蛋白結合在細胞內發揮作用，或者可以作為細胞因子作用于細胞外(Morenoet al, 2018; Okumuraet al, 2007)。魚類中，ISG15 是魚體被病毒感染后經干擾素誘導最早表達且表達量最高的蛋白之一(álvarezet al, 2018; Zhanget al, 2007)。Liu 等(2010)研究報道，美國紅魚(Sciaenops ocellatus)的ISG15 同源物能夠直接表現出免疫調節的特性。鱈(Gadus morhua) (R?keneset al, 2007)、鮭(Salmo salar) (Seppolaet al, 2007)和鯽(Carassius auratus) (Furneset al, 2009)的ISG15 同源物能夠與細胞蛋白形成復合物發揮抗病毒的作用。因此，isg15不僅能夠調節免疫反應，還具有直接的抗病毒作用，研究魚類isg15對于解析魚類抗病毒分子的免疫機制具有重要意義。

高職院校從事跨語言文化教學的教師很多不具備跨文化背景和交流經驗，深入開展跨文化教學時顯得力不從心，有些教師在處理跨文化教學上缺乏一定的經驗、方法和技巧。

鞍帶石斑魚(Epinephelus lanceolatus)是一種名貴的海水養殖品種，隨著消費需求的增長，養殖密度不斷增加，病害問題已成為制約石斑魚類養殖業健康可持續發展的主要瓶頸。目前，虹彩病毒(iridovirus)是海水和淡水養殖魚類最嚴重的病毒性病原之一，在世界各地已從 100 多種魚類中分離鑒定出虹彩病毒(Grayet al, 2015)。虹彩病毒是危害石斑魚類最大的傳染病之一(Ohtaet al, 2011)，但關于鞍帶石斑魚干擾素刺激基因15 的克隆及功能研究尚未見報道。

本研究以鞍帶石斑魚為研究對象，對其isg15基因進行全長cDNA 克隆并初步分析其結構特征，采用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)技術檢測了該基因在鞍帶石斑魚不同組織中的表達模式，以及感染虹彩病毒后主要免疫組織的表達特征，旨在為探究isg15基因在鞍帶石斑魚免疫應答中的作用機制提供數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 正常組織 本實驗所用的鞍帶石斑魚取自海南晨海水產有限公司，采集18 月齡健康鞍帶石斑魚，麻醉后用注射器對心臟取血，然后解剖取其心臟、肝臟、鰓、腸、皮膚、腎臟、脾臟、腦等組織，將組織樣品立即放入RNA 保存液中，存放于-80℃冰箱，用于提取正常組織RNA。

《普通高中數學課程標準(實驗)》強調：“數學教學要使學生通過不同形式的自主學習、探究活動，體驗數學發現和創造的歷程.”從數學學科特點出發,根據不同的教學內容,有效合理地組織學生開展“探究教學”，是追求有效教學、構建高效課堂的重要途徑.在目前課堂教學中，“探究教學”中探究的成分太少,有種“貼標簽”的嫌疑.筆者認為，數學課堂教學過程中的每一個環節都可以滲透探究的元素、探究方法、探究思想.我們應力求讓探究成為數學課堂教學的常態,應善于把握課堂教學中的每一個探究機會和細節，使數學探究逐步成為學生學習的自覺行為乃至形成習慣,促進學生思維充分、健康、全面發展.

康鞍帶石斑魚腹腔注射虹彩病毒(由華南農業大學的秦啟偉教授提供)進行感染，每尾100 μL (109拷貝數)。在感染后的0、12、24、72 和96 h 共5 個時間點，以磷酸緩沖液(PBS)作為對照，分別取5 尾鞍帶石斑魚，將活魚麻醉后迅速采集脾臟和腎臟組織，放入RNA 保存液中，存放于-80℃冰箱。

1.2 鞍帶石斑魚總RNA 提取及cDNA 第一鏈的合成

用于全長克隆的總RNA 提取按照RNAiso Plus Total RNA (TaKaRa)提取試劑說明書進行操作，提取的 RNA 經瓊脂糖凝膠電泳檢查完整性，并利用NanoDrop2000 超微量分光光度計測定RNA 濃度及純度，判斷核酸和蛋白質的污染情況。選取質量良好的RNA，按照PrimeScript Ⅱ 1st strand cDNA synthesis kit (TaKaRa)和SMARTer RACE 5′/3′ kit 的操作說明書進行反轉錄，分別得到cDNA、5'RACE cDNA 及3'RACE cDNA，保存至-20℃冰箱，分別用于isg15基因中間片段的克隆以及5′RACE 和3′RACE 擴增。

1.3 isg15 基因的全長cDNA 的克隆

1.3.1 中間片段的克隆驗證 中國水產科學研究院黃海水產研究所陳松林團隊主導完成了鞍帶石斑魚全基因組測序和精細圖譜繪制(Zhouet al, 2019)，首先，根據鞍帶石斑魚基因組數據庫中的部分isg15序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設計引物(isg15-F1/isg15-R1)(表1)，以cDNA 為模板進行PCR 擴增：Mix 7.5 μL，isg15-F1 0.6 μL，isg15-R1 0.6 μL，ddH2O 5.3 μL，模板cDNA 1 μL。程序：95℃預變性5 min；95℃ 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸55 s，35 個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠回收試劑盒回收、純化，再利用T-A 克隆方法克隆到pEAZY-T1 載體上，轉化至大腸桿菌感受態細胞中，涂板于含氨芐西林的固體培養基，37℃過夜培養12～16 h，挑取單菌落于1 mL含氨芐西林的液體培養基中，37℃ 200 r/min 震蕩培養6 h，進行菌液PCR 檢測，挑取陽性克隆。將含有目的片段的陽性菌落交由北京睿博興科生物技術有限公司(青島區)進行測序(王雙艷等, 2019)。

鞍帶石斑魚isg15基因編碼的氨基酸序列經BLAST 比對發現，與其他硬骨魚類的isg15基因有較高的同源性，與斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)的相似性為88.24%，與大菱鲆(Scophthalmus maximus)、大黃魚(Larimichthys crocea)和條石鯛(Oplegnathus fasciatus)的相似性為61.18%、60.59%和60.00%，與爬行動物陸龜(Gopherus evgoodei)的相似性為33.53%，與2 種哺乳動物小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的相似性為32.94%和31.18% (表2)。

青海三江源、青海湖流域、祁連山等重大生態保護工程生態監測數據庫框架已經搭建，積累了大量完整和連續的監測數據，但如何利用數據庫開發提煉出具有參考價值的資料，還有待深入研究，并將研究成果及時提供給決策管理部門，使其真正為管理決策提供服務，所以加強生態監測數據庫的研發應列入議事日程。

1.4 isg15 基因的序列分析及進化樹的構建

利用在線軟件ExPASy (http:www.au.expasy.org)對isg15基因的cDNA 序列進行蛋白翻譯、分子量及等電點預測；使用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)預測保守結構域。在NCBI 上下載同源序列，利用 DNAman 進行同源序列比對分析(王杉等,2020)，利用 MEGA5.1 軟件以鄰位法(Neighborjoining, NJ)構建系統發育樹。

使用qRT-PCR 檢測健康的鞍帶石斑魚不同組織中的表達量；使用qRT-PCR 檢測鞍帶石斑魚經過虹彩病毒感染刺激后5 個時間點的脾臟和腎臟的表達情況。根據isg15基因全長序列，設計qRT-PCR 正反向引物(isg15-RT-F/isg15-RT-R)(表1)，并以(ACTINRT-F/ACTIN-RT-R)(表1)作為內參基因。以鞍帶石斑魚在感染虹彩病毒后不同時間的脾臟和腎臟cDNA為模板，在 7500 Fast Real-time PCR 儀上進行qRT-PCR。20 μL 體系：10 μL SYBR，上、下游引物(10.0 μmol/L)各0.8 μL，0.4 μL ROX reference dye Ⅱ，cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。每次反應均設陰性對照和無模板對照，每個反應設3 個重復。擴增程序：95℃5 min，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 個循環。所得實驗數據采用相對CT 法(2-ΔΔCt)進行isg15基因mRNA 的表達量計算，實驗得到的數據采用SPSS 軟件進行方差分析，設定P＜0.05 為差異顯著。

為研究isg15基因在健康魚類中的表達模式，采用熒光定量PCR 技術檢測isg15基因在鞍帶石斑魚健康個體的不同組織內基因相對表達水平變化。結果顯示，isg15基因主要在血液中表達，肝臟、腎臟中的mRNA 水平較高，其次是鰓、腸、心臟、脾臟、皮膚、大腦和肌肉(圖4)。

1.5 鞍帶石斑魚isg15 基因的表達模式檢測

1992年，姜友善進入舒蘭供銷社農業生產資料有限公司工作。在同眾多化肥生產廠家打交道的過程中，他與中阿撒可富結下了深厚的友誼。“為了讓農民受益，我在選擇合作廠家時，不看品牌的大小，只選擇有良心的企業。”姜友善感慨說，“在舒蘭，我和中阿撒可富是老相識，從開始干農資就一直保持著密切的合作。這么多年下來沒有中斷，憑的就是農民的認可和廠商間志同道合的相互信任。”

1.1.2 虹彩病毒感染及樣品收集 將18 月齡的健

2 結果與分析

2.1 鞍帶石斑魚isg15 基因的克隆及序列分析

鞍帶石斑魚isg15基因序列全長為910 bp，其中，5′-非編碼區為64 bp，開放閱讀框為468 bp，3′-非編碼區為378 bp，預測分子量為17.09 kDa，理論等電點為9.33(圖1)。SMART 軟件預測鞍帶石斑魚ISG15含有2 個類泛素結構域UBQ(ubiquitin-like domain)，分別在1～76 和86～156 位置，其中，C 端結構域含有泛素C 末端具有的LRLRGG 結構域(圖1)。

圖1 鞍帶石斑魚isg15 基因的cDNA 序列及其編碼序列Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequences of E. lanceolatus isg15

2.2 isg15 基因多序列比對及系統進化樹分析

1.3.2 5′RACE 和3′RACE 的克隆 根據克隆得到的isg15基因片段序列，分別設計5′RACE 和3'RACE的特異性擴增引物(5′-RACE-GSP/5′-RACE-NGSP 和3′-RACE-GSP/3′-RACE-NGSP)(表1)。分別以5′RACE cDNA 和 3′RACE cDNA 為模板進行 5′RACE 和3′RACE 擴增，第1 輪反應體系為10 μL，根據TaKaRaTaqTMHot Start Version 說明書介紹的體系比例加樣混合，進行Touch down PCR 程序反應。第1 輪PCR 反應產物稀釋50 倍作為第2 輪普通PCR 擴增反應的模板，反應體系為50 μL，同上按比例加樣混合后進行PCR 反應，將得到的PCR 產物根據中間片段的克隆的驗證方法處理并測序。

表2 鞍帶石斑魚和其他物種的ISG15 的氨基酸相似性Tab.2 Degree of homology similarity between ISG15 of E. lanceolatus and other vertebrates

使用DNAman 進行氨基酸多重序列比對，結果顯示，不同物種間的ISG15 序列非常保守(圖2)。為了確定isg15的系統進化關系，通過MEGA 5.1 軟件，采用Neighbor-joining 法構建了脊椎動物isg15系統進化樹(圖3)。系統發育分析顯示，9 種魚類的isg15聚為一簇，爬行動物陸龜分為一支，2 種哺乳動物的isg15聚為一簇。

根據基因測序獲得的isg15基因5′和3′及中間片段序列，利用DNAman 軟件進行拼接，獲得isg15基因全長序列。

圖2 ISG15 的氨基酸序列多重序列比對結果Fig.2 The multiple sequence alignment of the ISG15 amino acid

圖3 鞍帶石斑魚isg15 與其他物種isg15 系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of isg15 sequence of E. lanceolatus with other vertebrate isg15

2.3 鞍帶石斑魚isg15 基因在健康個體中的表達模式

阿東說：“他只有這點享受，我就要讓他聽。你拿給我，你不給我，我明天辭職，我帶他到鄉下去住。我到沒有人的地方天天放給他聽。”

圖4 鞍帶石斑魚isg15 基因在不同組織的表達分布Fig.4 Expression profile of isg15 in different tissues of E. lanceolatus

2.4 注射虹彩病毒后isg15 基因在脾臟的表達模式

本研究采用熒光定量PCR 技術檢測isg15基因在魚體注射虹彩病毒的處理下，脾臟在不同時間(0、12、24、72 和96 h)基因相對表達水平變化。isg15基因在魚體注射虹彩病毒后脾臟中相對表達變化的檢測結果顯示，與0 h 相比，各組脾臟內isg15基因的相對表達量在感染后72 h 顯著上調至8.3 倍，在感染后96 h 降低為6.6 倍(圖5)。

圖5 虹彩病毒感染后鞍帶石斑魚isg15 基因在脾臟中的表達分布Fig.5 The expression of E. lanceolatus isg15 in spleen after iridovirus infection

2.5 注射虹彩病毒后isg15 基因在腎臟的表達模式

isg15基因在魚體注射虹彩病毒后腎臟中相對表達變化的檢測結果顯示，isg15基因的相對表達量在腎臟中的表達變化更為劇烈，72 h 時其轉錄水平上調約11 倍，96 h 時下降至6.5 倍(圖6)。

圖6 虹彩病毒感染后鞍帶石斑魚isg15 基因在腎臟中的表達分布Fig.6 The expression of E. lanceolatus isg15 in kidney after iridovirus infection

3 討論

本研究通過PCR 及RACE 方法成功獲得了鞍帶石斑魚isg15基因cDNA 的全長序列。SMART 在線軟件預測鞍帶石斑魚ISG15 含有2 個類泛素結構域UBQ，然而與泛素相比，ISG15 與目的蛋白結合并不會導致靶蛋白的降解，而是發揮生理信號功能，與基因轉錄調控、蛋白質翻譯以及機體應激反應等生理過程有密切聯系(Liuet al, 2014)。鞍帶石斑魚ISG15 的C 端結構域也含有泛素C 末端相同的LRLRGG 結構域，其對ISG15 與細胞內靶蛋白分子的連接極其重要(圖1)。大多數泛素或類泛素樣蛋白通過在LRLRGG結構域的末端加上幾個氨基酸，從而使其處于失活狀態，而類泛素樣蛋白的活化則通過蛋白酶釋放有活性的尾部(Daoet al, 2005)。isg15基因是ISGs 家族的重要成員之一，各個物種中的isg15基因均具有一定的保守性和保守功能(Morenoet al, 2018)。序列分析顯示，克隆獲得的鞍帶石斑魚isg15與斜帶石斑魚上的isg15相似度最高，達到88.24%，與大菱鲆、大黃魚和條石鯛的相似性高于60%，與哺乳動物人和小鼠的相似性高于30%(圖2)，這說明了親緣關系越相近的物種，同源性越高。鞍帶石斑魚和其他幾種已報道的魚類，如斜帶石斑魚、條石鯛、棘鯛等的ISG15 蛋白C 端LRLRGG 結構域之后沒有末端氨基酸，說明其處于天然活化狀態，推測鞍帶石斑魚的ISG15 具有天然的抗病毒作用。

在測量小直徑(激光測徑儀量程范圍內<25mm)和大直徑(>25mm)的塞規由于測量原理不同，所引入的誤差并不相同，因此應該分別進行分析。對于小直徑的塞規尺寸測量引入的誤差包括激光測徑儀的測量誤差u1為0.5μm；兩頂尖的同軸度誤差會使安裝的塞規產生傾斜，導致測量的直徑產生偏差λ，其中 λ=d(1/cosθ-1)，θ=arctan(l/L)，l為塞規在豎直方向的傾斜，L為塞規全長。當l取極大值5μm時，λ非常小，可以忽略；嵌入式軟件對測量數據的處理結果對實際正確結果的偏差值服從正態分布，且其方差為0.001 4μm，這里根據拉依達準則取測量系統[10]的不確定度u2為0.004 2μm。

最初研究證明，魚類中的I 型IFN 具有抗病毒活性，對包括斑馬魚(Danio rerio)中的蛇頭橫紋肌病毒(Altmannet al, 2003)、鮭中的傳染性胰腺疾病(IPNV)(Robertsenet al, 2003)和斜帶石斑魚中的神經壞死病毒(NNV) (Ohtaet al, 2011)都有抑制作用。后期研究發現，IFN 還能夠誘導ISG15 的表達。ISG15 通過與JAK1 和STAT1 等重要干擾素信號通路成員的結合，調控細胞對干擾素信號的反應(Malakhovet al,2003)。最新研究證明，isg15具有直接的抗病毒能力，其中，Wang 等(2012)研究發現，半滑舌鰨的isg15基因具有非結合形式的抗病毒能力；Langevin 等(2013)研究發現，斑馬魚isg15在EPC 細胞中過表達后能夠抑制虹彩病毒等病毒的感染。因此，isg15是抗病毒防御體系的重要部分，可以在動物機體抗病毒方面發揮重要作用，但isg15在石斑魚類抗病毒反應中的作用機制和調控通路需要進一步研究。

本研究對isg15基因在健康鞍帶石斑魚各個組織中的表達模式進行了探究，發現isg15基因在鞍帶石斑魚的各個組織中均有表達，在血液中表達量最高，在肝臟、腎臟中的表達水平較高，說明isg15主要在免疫組織中表達。魚類免疫相關的基因在血液中表達較高的現象也早有報道，如牙鲆的efhd2和tbcld25基因在血液中表達量最高(侯吉倫等, 2019)。血液也是魚體重要的免疫器官，是各類免疫細胞和免疫因子的天然攜帶者，在魚體免疫應答過程中發揮重要的生理和生化作用。血液也是魚體內各個器官間物質運輸的載體，機體受到感染時，血液中的細胞因子能夠快速到達病區。因此，推測在病毒感染后，鞍帶石斑魚isg15基因在血液中快速表達，隨著血液流動運輸到病毒攻擊的部位，發揮抗病毒的免疫作用。本研究對虹彩病毒感染后鞍帶石斑魚isg15的表達變化檢測發現，在脾臟和腎臟中，isg15的相對表達量呈現先升高后下降的趨勢，在感染虹彩病毒72 h 出現峰值，其中，在脾臟中升高了8 倍，在腎臟中升高了近11倍，說明鞍帶石斑魚isg15基因在對抗虹彩病毒感染的過程中響應快速，在脾臟和腎臟中發揮著重要的防御作用。

綜上所述，本研究首次對鞍帶石斑魚isg15基因進行了cDNA 全長克隆、進化分析及表達模式研究，同時，證明isg15基因在魚體血液中的相對表達量遠高于其他內臟組織，在脾臟和腎臟中發揮著防御病毒的作用，可為進一步研究isg15在抗病分子育種中的作用機制提供理論基礎。