微波輔助高壓法提取金針菇黃酮的純化及活性測定

王廣慧，于德涵，黎 莉

(綏化學院 食品與制藥工程學院， 黑龍江 綏化 152061)

金針菇(FLammuLinaveLutipes(Fr.)Sing)是我們非常熟悉的一種食用菌。它具有很高的營養(yǎng)價值，富含蛋白質(zhì)、多糖、黃酮、維生素、礦物質(zhì)及各種人體所必需的氨基酸等營養(yǎng)成分，尤其是金針菇中的黃酮類物質(zhì)具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用，可開發(fā)為保健食品或動物飼料添加劑[1-5]。大孔樹脂常被用于黃酮類物質(zhì)的純化，因其具有良好的穩(wěn)定性、強吸附性以及可以在溫和的條件下重復使用等優(yōu)點[6]，但目前關(guān)于將大孔樹脂用作金針菇黃酮純化介質(zhì)的研究甚少。本項目組曾在文獻[7]中探討了微波輔助高壓法制備金針菇黃酮的最佳條件，筆者將在此基礎上繼續(xù)研究以H103型大孔樹脂作為金針菇黃酮純化介質(zhì)的工藝條件，并通過抑菌和抗氧化實驗檢測金針菇黃酮的活性，以期為其未來的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

H103型大孔吸附樹脂(天津浩聚樹脂科技有限公司)；實驗所用各種化學試劑都為國產(chǎn)分析純，購自常州市旭宏化工有限公司；金針菇及所用四種細菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌)均為綏化學院發(fā)酵實驗室培養(yǎng)所得。

1.2 儀器

752型分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)； YM50FG型立式高壓蒸汽滅菌器(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；WBFY-205型微波化學反應器(上海一科儀器有限公司)。

2 方法

2.1 金針菇黃酮的提取

金針菇黃酮的提取方法及含量測定方法(硝酸鋁-亞硝酸鈉法)均按照文獻[7]中所述步驟進行操作。

2.2 H103型大孔樹脂的預處理

用95%乙醇先將H103型大孔樹脂浸泡24 h，然后反復清洗至液體澄清，再用蒸餾水洗至乙醇味消失。再先后用5%(g·g-1)的鹽酸溶液和4%(g·g-1)的氫氧化鈉溶液各浸泡處理4 h，每次處理后都要用蒸餾水清洗至pH值為中性。

吸附率和解析率的計算公式：

式中：C1代表上樣液中金針菇黃酮的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)，C2代表吸附飽和時流出液中金針菇黃酮的質(zhì)量濃度，C3代表洗脫液中金針菇黃酮的質(zhì)量濃度；V1代表吸附飽和時所消耗的上樣液體積(mL)，V2代表吸附飽和時流出的液體體積，V3代表洗脫液體積。

2.3 純化工藝優(yōu)化[8]

將預處理過的H103型大孔樹脂裝入普通玻璃層析柱(16 mm×240 mm)中，樹脂高度為12 cm，分別考察樣品液的pH、濃度、上樣速度對金針菇黃酮吸附率的影響，以及乙醇的濃度、洗脫速度、用量對黃酮解析率的影響。每組實驗重復三次。

2.4 純化效果檢測

按優(yōu)化后的最佳條件用H103型大孔樹脂對金針菇黃酮進行純化，然后通過計算金針菇黃酮在解析液及樣品液烘干后物質(zhì)中所占的比例，求得純化倍數(shù)。

2.5 抗菌活性測定[9～12]

采用抑菌圈法進行檢測。

2.5.1 菌懸液的制備 在37℃下，用氣浴恒溫振蕩器以120 r·min-1的轉(zhuǎn)速連續(xù)培養(yǎng)四種活化菌株，并持續(xù)關(guān)注菌懸液在波長600 nm處的OD值，當其為0.1時停止培養(yǎng)。菌體濃度此時約為1×106～1×107CFU( Colony-Forming Units，菌落形成單位) ·mL-1。

2.5.2 抑菌活性檢測實驗 將四種菌懸液各0.1 mL涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上，插入牛津杯(內(nèi)徑6 mm)，取0.1 mL質(zhì)量濃度分別為0.10、0.25、0.40、0.55、0.70 mg·mL-1的金針菇黃酮樣品液加入杯中，37℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

2.6 抗氧化實驗[11～14]

2.6.1 清除ABTS·能力檢測 在250 mL容量瓶中加入40.00 mg的ABTS、10 mL的蒸餾水以及8.00 mL的過硫酸鉀(濃度為1.0 mg·mL-1)，室溫避光反應16 h。加蒸餾水32 mL，以無水乙醇定容后靜置10 h備用。

取濃度分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg·mL-1的金針菇黃酮溶液各0.5 mL，加入1.5 mL 95%乙醇及2 mL配制好的ABTS溶液，反應30 min后測其在734 nm處的光吸收值A1。

將ABTS溶液換成蒸餾水，重復上述步驟，所測吸光值為A2。保留ABTS溶液，以95%乙醇代替黃酮提取物，重復上述步驟，所測吸光值為A0。同時以VC為對照。

2.6.2 清除DPPH·能力檢測 取3.5 mL 的DPPH溶液(濃度為1.0×10-4mol·L-1，以無水乙醇配制而成)與0.5 mL無水乙醇混合，閉光反應30 min，測其在517 nm處的吸光值 A0；

以0.5 mL純化后的金針菇黃酮提取液替代0.5 mL無水乙醇，按上述方法進行操作，測得其吸光值 A1；

以3.5 mL 無水乙醇替代DPPH溶液，同樣加入0.5 mL黃酮提取液，測得其吸光值 A2。所用對照品為VC。

2.6.3 清除OH·能力檢測 在2.0 mL FeSO4溶液(1.8 mmoI·mL-1)中各加入1.0 mL濃度分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg·mL-1的金針菇黃酮溶液，再加入1.8 mmol·mL-1的水楊酸-乙醇溶液1.5 mL和0.3%(g·mL-1)的過氧化氫溶液 0.1 mL，混合均勻。在37 ℃水浴中靜置30 min后測其在510 nm下的吸光值A1。

將過氧化氫溶液換成蒸餾水，重復上述實驗操作，所測吸光度值為A2。

將黃酮提取液換成蒸餾水，重復上述實驗操作，所測吸光度值為A0。所用對照品依然為VC。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性回歸方程

實驗所得測定黃酮含量的線性回歸方程為y = 10.273x + 0.001 2, R2= 0.9959。其中y為吸光值，x為黃酮濃度(mg·mL-1)。

3.2 純化工藝優(yōu)化結(jié)果

3.2.1 上樣液pH對吸附率的影響 用5%鹽酸溶液和2%的氫氧化鈉溶液將濃度為1.45 mg·mL-1的金針菇黃酮樣品液pH調(diào)為3、4、5、6、7，以0.3 mL·min-1的流速進行吸附，然后計算飽和吸附率(飽和吸附點的判定標準為：流出液中黃酮濃度約為其上樣液中初始濃度的十分之一)。

實驗結(jié)果見圖1。

圖1 上樣液pH對吸附率的影響

由圖1可知，在所測定的樣品液pH范圍內(nèi)，當樣品液的pH大于5.0時，黃酮吸附率隨樣品液pH的增大而減小；當樣品液的pH在3.0～5.0范圍內(nèi)，吸附率呈上升趨勢；當樣品液pH為5.0時，黃酮吸附率達到最大值。分析原因可能是金針菇黃酮屬于多羥基酚類化合物，只有在適當酸性條件下能夠形成氫鍵，利于大孔吸附樹脂吸附。當酸性太強時，黃酮分子內(nèi)的氧原子易質(zhì)子化，不易被吸附；而在堿性條件下黃酮分子中形成酚氧負離子，影響氫鍵的形成，也會導致吸附率下降。

3.2.2 上樣液濃度對吸附率的影響 考察時所設定的吸附條件是：pH5的樣品液，吸附速率為0.3 mL·min-1，樣品液濃度分別為0.85、1.15、1.45、1.75、2.05 mg·mL-1。實驗結(jié)果見圖2。

圖2 上樣液濃度對吸附率的影響

由圖2可知，在所測量的上樣液濃度范圍內(nèi)，在0.85～1.45 mg·mL-1時，吸附率逐漸增加；當濃度大于1.45 mg·mL-1時，吸附率隨濃度的增加而降低。因此選擇1.45 mg·mL-1作為上樣液最適濃度。

3.2.3 上樣液流速對吸附率的影響 考察時所設定的吸附條件是：樣品液pH為5，上樣液濃度為1.45 mg·mL-1，流速分別為0.30、0.55、0.80、1.05、1.30 mL·min-1。

實驗結(jié)果見圖3。

圖3 上樣液流速對吸附率的影響

由圖3可知，吸附率隨上樣液流速逐漸加快而逐漸降低，說明較慢的上樣速度利于樹脂對黃酮的吸附，但流速太慢勢必會使吸附時間過長，綜合考慮工作效率問題，選擇0.30 mL·min-1為最佳流速。

3.2.4 洗脫劑濃度對解析率的影響 先用蒸餾水反復沖洗已飽和吸附有金針菇黃酮的H103型大孔吸附樹脂層析柱，直至流出的液體無色，再用60 mL乙醇以2 mL·min-1的速率進行洗脫，乙醇濃度分別設為50%、60%、70%、80%、90%。計算黃酮解析率。

實驗結(jié)果見圖4。

圖4 洗脫劑濃度對解析率的影響

由圖4可知，最佳洗脫劑濃度為70%，乙醇體積分數(shù)過大或過小都不利于黃酮的洗脫。

3.2.5 洗脫速率對解析率的影響 設定洗脫速率分別為2、2.5、3、3.5、4 mL·min-1，洗脫劑乙醇的濃度采用70%，乙醇用量采用60 mL，在此條件下分析黃酮解析率。

實驗結(jié)果見圖5。

圖5 洗脫速率對解析率的影響

由圖5可知，洗脫速率越小越有利于洗脫，原因可能是速率小時可使乙醇與樹脂充分接觸，宜于黃酮的洗脫，但速率過小會過分延長洗脫時間，因此綜合考慮工作效率，選擇2 mL·min-1為最佳洗脫速率。

3.2.6 洗脫劑用量對解析率的影響 用70%乙醇以2 mL·min-1進行洗脫，洗脫劑用量分別設為10、20、30、40、50、60 mL，計算黃酮解析率。

實驗結(jié)果見圖6。

圖6 洗脫劑用量對解析率的影響

由圖6可知， 60 mL 70%乙醇可將大孔樹脂上吸附的金針菇黃酮徹底洗脫。

3.3 純化效果檢測

檢測結(jié)果見表1。

表1 純化效果檢測結(jié)果

由此表可見，純化倍數(shù)可達3.27倍，說明用此工藝純化金針菇黃酮能取得比較好的效果。

3.4 抗菌實驗

測量3組平行實驗所獲得的抑菌圈直徑，取平均值后所得數(shù)據(jù)見表2。

表2中數(shù)據(jù)表明，在所測量的0.10～0.70 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，金針菇黃酮對四種菌株都表現(xiàn)出一定程度的抗菌活性，且總體趨勢是黃酮濃度越大，抗菌活性越強，其對四個菌種抗性順序為：大腸桿菌最強，沙門氏菌次之，金黃色葡萄球菌第三，枯草芽孢桿菌最弱。

表2 黃酮濃度對菌種抑菌圈直徑的影響

3.5 抗氧化實驗

3.5.1 清除ABTS·能力檢測結(jié)果 金針菇黃酮和VC清除ABTS·能力比較見圖7。

圖7表明，金針菇黃酮對ABTS·有一定的清除能力，并且黃酮濃度越高，對ABTS·的清除能力也越強，但與相同濃度的VC相比，金針菇黃酮對ABTS·的清除率低于VC。

3.5.2 清除DPPH·能力檢測結(jié)果 金針菇黃酮和VC清除DPPH·能力比較見圖8。

圖8 黃酮和Vc清除DPPH·能力比較

圖8表明，金針菇黃酮和VC對DPPH·都有清除能力，并且隨著濃度升高，二者對 DPPH·的清除作用也越強，但相對于VC，金針菇黃酮的清除率上升幅度不是很明顯，且在相同濃度時，金針菇黃酮清除DPPH·的能力弱于VC。

3.5.3 清除OH·能力檢測結(jié)果 金針菇黃酮和VC清除OH·能力比較見圖9。

圖9表明，金針菇黃酮和VC對OH·都具有一定的清除能力，并且二者對OH·的清除能力與濃度呈正相關(guān)，但在相同濃度下，金針菇黃酮對OH·的清除能力不如VC強。

圖9 黃酮和Vc清除OH·能力比較

4 結(jié) 論

對利用微波輔助高壓法制取的金針菇黃酮的生物活性進行了檢測，并對H103型大孔樹脂作為金針菇黃酮純化介質(zhì)的最適條件進行了探討。由研究結(jié)果可以做出以下結(jié)論：

(1)H103型大孔樹脂純化金針菇黃酮的效果很好，其最優(yōu)純化條件為：采用濃度為1.45 mg·mL-1、pH值為5的上樣液以0.30 mL·min-1的流速進行吸附；采用體積分數(shù)為70%的乙醇60 mL以2 mL·min-1的流速進行洗脫。按此純化條件得到的黃酮純度可達到純化前的3.27倍。

(2)抗菌性研究顯示：金針菇黃酮對四種實驗用菌都有一定的抑制作用，抑菌效果與金針菇黃酮濃度呈正相關(guān)。對四種菌株抗菌能力由強至弱順序為: 大腸桿菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌。

(3)氧化抗性實驗結(jié)果表明：金針菇黃酮具有一定的氧化抗性，能有效消除ABTS·、DPPH·和OH·，并且隨著濃度的增加，其抗氧化活性也在增強，但低于同濃度下的VC。

由此可見，利用微波輔助高壓法提取金針菇黃酮不但可獲得較高的提取率[13]，且能保留黃酮的抑菌性和抗氧化性；使用H103型大孔樹脂能對金針菇黃酮起到很好的純化作用。這為金針菇黃酮產(chǎn)品的開發(fā)提供了依據(jù)。