超聲波輔助提取黃花菜中類胡蘿卜素工藝研究

吳天珍，孫利平，張慶霞，竇宗信，李冠男，高 峰

(甘肅農業職業技術學院,甘肅 蘭州 730030)

黃花菜(Hemerocallis Citrina Baroni)又稱金針菜，屬百合科萱草屬，為多年生宿根植物，食用部分為花蕾，是我國的特色蔬菜[1]。甘肅慶陽是久負盛名的黃花菜之鄉。2006年12月22日原國家質檢總局批準對“慶陽黃花菜”實施地理標志產品保護。2019年慶陽黃花菜面積達到4.67萬hm2以上，黃花菜產業也逐步成為當地群眾脫貧奔小康的“金色產業”。黃花菜集營養、藥療、觀賞于一體，尤其是其營養價值遠遠高于其他蔬菜[2]。黃花菜蛋白量高、熱值低、富含維生素及礦物質。發現的主要化學成分有生物堿、黃酮類、維生素、類胡蘿卜素、揮發油、靴質以及無機礦物如鈣、磷、鈉、鉀、錳、銘、鋇和鋁等，其所含的類胡蘿卜深度比拘祀子大三倍，甚至超過西紅柿的幾倍[3]。類胡蘿卜素是一類天然化合物的總稱, 大量存在于植物中，還存在于許多微生物(如光合細菌)和動物體內，是生物體必不可少的成分。類胡蘿卜素呈黃色、紅色或橙紅色, 具有食品著色劑和營養增補劑的雙重功效, 因而被廣泛應用于食品、化妝品和飼料添加劑中[4]。近年來的醫學研究證明, 類胡蘿卜素具增強免疫力、抗氧化和延緩衰老、預防腫瘤和心腦血管疾病、抗癌癥等功能[5]。因此, 類胡蘿卜素在國內外食品、醫藥工業中一直處于供不應求的狀態。目前，類胡蘿卜素的提取方法主要包括：有機溶劑提取法、層析法、超臨界CO2萃取法和超聲波法等[6]。超聲波能產生并傳遞強大的能量，促進細胞內有效成分的溶出，具有操作簡便、能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點[7]。因此，筆者試驗利用單因素試驗和正交試驗對超聲波法提取黃花菜中類胡蘿卜素的工藝進行了優研究，以期為黃花菜中類胡蘿卜素的提取提供技術參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試驗樣品：2020年7月下旬在甘肅省慶陽市西峰區后官寨采集黃花菜花蕾。

試驗試劑：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、正己烷和BHT抗氧化劑, 均為分析純。

實驗儀器：PL203型電子天平；TGL-20M湘儀離心機 ；TU-1900雙束紫外可見光分光光度計北京普析通用儀器； KH3200B型超聲波清洗儀 ；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-91013SA型)

1.2 方法

1.2.1 黃花菜中類胡蘿卜素提取工藝過程 黃花菜鮮樣→蒸餾水浸泡30 min左右(除去糖分及秋水仙堿)→烘箱烘干(50℃)→粉碎(60目)→稱取黃花菜粉末0.25 g→加入含有0.1%BHT的有機溶劑25 mL→超聲波輔助提取→離心取上清液→定容至50 mL→測定吸光度值→計算類胡蘿卜素含量。

1.2.2 黃花菜中類胡蘿卜素測定條件選擇 利用UV-型紫外可見光分光光度計，以提取溶劑為空白對照在波長350～600 nm下掃描，確定所提黃花菜類胡蘿卜素的最佳吸收波長。采用不同的有機提取溶劑及配比：甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、丙酮石油醚(1∶1)、丙酮乙醇(1∶1)，按1.2.1提取工藝確定最佳提取溶劑。

1.2.3 黃花菜中類胡蘿卜素含量計算 黃花菜中類胡蘿卜素的總含量以Y記，單位 (mg·100g-1)，按以下公式進行計算[8]：

式中：A-在445nm波長下提取液樣品的吸光值；V-類胡蘿卜素提取液樣品體積(mL)；N-提取液樣品稀釋的倍數；2500-1%類胡蘿卜素在最大吸收波長是的平均吸光值；m-類胡蘿卜素提取液樣品的質量(g)。

1.2.4 單因素試驗 通過單因素試驗分別考察料液比、超聲時間、超聲溫度和超聲功率對提取黃花菜類胡蘿卜素含量的影響。

(1)料液比對提取黃花菜類胡蘿卜素含量的影響。稱取黃花菜粉末0.25 g，按料液比(g:mL)分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25加入含0.1%BHT的丙酮乙醇(1∶1)提取溶劑。設置超聲時20 min、超聲溫度45℃、超聲功率200 W,篩選提取類胡蘿卜時最佳的料液比。

(2)超聲溫度對提取黃花菜類胡蘿卜素含量的影響。稱取黃花菜粉末0.25 g，加入含有0.01%BHT的丙酮石乙醇(1∶1)有機提取溶劑10 mL。設置超聲時間20 min、超聲功率200 W，考察超聲溫度25、35、45、55、65℃對提取類胡蘿卜素含量的影響。

(3)超聲時間對提取黃花菜類胡蘿卜素含量的影響。稱取黃花菜粉末0.25 g，加入含有0.01%BHT的丙酮乙醇(1∶1)有機提取溶劑10 mL。超聲溫度設置為45℃、超聲功率200 W，分析超聲時間10、20、30、40、50 min對提取類胡蘿卜素含量的影響。

(4)超聲功率對提取黃花菜類胡蘿卜素含量的影響。稱取黃花菜粉末0.25 g，加入含有0.01%BHT的丙酮石油醚(1∶1)有機提取溶劑10ml。超聲溫度設置為45℃、超聲時間20 min，分析超聲功率100、150、200、250、300 W對類胡蘿卜素提取含量的影響。

1.2.5 正交試驗 以單因素試驗為基礎，對料液比、超聲溫度、超聲時間和超聲功率進行L9(34)正交試驗，優化黃花菜中類胡蘿卜素提取工藝。正交試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗中的因素與水平

2 結果與分析

2.1 類胡蘿卜素提取條件的篩選

2.1.1 最佳吸收波長確定 用分光光度測定類胡蘿卜素含量時，在定量測定前，應使用紫外-可見光分光光度計對樣品進行最佳吸收波長的掃描測定，以便后續測定的準確性[9]。在350～600 nm條件下對黃花菜類胡蘿卜素提取溶液進行波長掃描，不同有機提取液的吸收光譜均具有類胡蘿卜素的特征吸收值。由圖1可以看出，以丙酮、石油醚、丙酮石油醚(1∶1)丙酮乙醇(1∶1)的類胡蘿卜素提取液吸收峰基本一致，均集中在440～480 nm波長下，其中445 nm下波長較為突出，因此選擇提取液類胡蘿卜素含量測定的波長為445 nm。

圖1 類胡蘿卜素提取溶劑在350～600nm下波長光譜

2.1.2 最佳提取溶劑的確定 不同種類的提取溶劑及提取溶劑間的組合，影響類胡蘿卜素的提取效率。由圖2可知，在提取效果上以丙酮石油醚(1∶1)最好，顯著高于其它提取溶劑；其次為丙酮乙醇(1∶1)和丙酮，在類胡蘿卜素的提取效果上上無顯著差異；再次為甲醇優于乙酸乙酯優于石油醚；正己烷提取效果較差。由于丙酮石油醚(1∶1)所提取類胡蘿卜素含量最多，因此確定為黃花菜類胡蘿卜素提取溶劑。

圖2 不同有機溶劑對類胡蘿卜素提取含量的影響

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比 從圖3可以看出，在低料液比時，所測得類胡蘿卜素含量隨料液比的增加而提高。當料液比超過(1∶20 g·mL-1)時類胡蘿卜素的含量增加趨于平穩，即此時材料中的類胡蘿卜素基本被提取出，此后在繼續增加料液比，所測類胡蘿卜素含量變化基本不明顯。在考慮高效，低成本的因素下，選取1∶20為最佳料液比。

圖3 不同料液比下類胡蘿卜素提取含量

2.2.2 超聲溫度 由圖4可知，超聲溫度低于35℃時，提取的類胡蘿卜素含量隨溫度的升高增加明顯，超聲溫度高于55℃之后，隨溫度的升高所測類胡蘿卜素的含量反而降低。可能是超聲溫度過高導致類胡蘿卜素發生降解，因此選55℃為超聲提取溫度。

圖4 不同超聲溫度下類胡蘿卜素提取含量

2.2.3 超聲時間 由圖5可知，所提類胡蘿卜素的含量隨超聲時間的延長呈現升高后下降的趨勢，超聲20min時類胡蘿卜素的含量為最大，此后隨超聲時間的延長所提類胡蘿卜素的含量呈下降趨勢, 超聲時間過長可能導致類胡蘿卜素的降解速率大于溶出速率，或者有雜質溶出,因此選擇超聲時間為20 min。

圖5 不同超聲時間下類胡蘿卜素提取含量

2.2.4 超聲功率 由圖6可以看出，超聲功率在100～250 W時，隨超聲功率的增加類胡蘿卜素的含量增加逐漸增加。在250 W時所提類胡蘿卜素的含量最高，之后增大超聲功率，反而類胡蘿卜素的含量略有下降。可能超聲功率過大時破壞類胡蘿卜素其成份的有效結構，因此選擇250 W為提取最佳功率。

圖6 不同超聲波功率下類胡蘿卜素提取含量

2.3 黃花菜類胡蘿卜素的超聲提取工藝的正交優化

表2為正交試驗結果，通過極差分析可知，RB>RA>RC>RD,對類胡蘿卜素含量的提取因素影響大小，依次為超聲溫度>料液比>超聲時間>超聲功率。在類胡蘿卜素提取時超聲溫度的影響最顯著，其中K2最大，表明水平B2效果好；其次是料液比，其K2值最大，表明水平A2效果好；然后是超聲時間以水平C2效果好；最后是超聲功率以水平D2效果好。由于超聲功率對類胡蘿卜素含量的提取影響不顯著，因此不用選擇其K值最大的水平。綜上所述最優的提取方案為A2B2C2D1，即制備黃花菜粉末中類胡蘿卜的最佳工藝條件為料液1∶20 g·mL-1、超聲溫度55℃、超聲時間20 min、超聲功率200 W。準確稱取3份樣品，在最佳工藝條件下進行3組平行試驗，測得其類胡蘿卜素提含量分別為62.25、62.19、62.03 mg·100g-1。由此可見，該方法試驗的重現性較好，穩定可行。

表2 類胡蘿卜素提取工藝的正交試驗結果

3 討論結論

(1)目前，對不同種類和組合的有機溶劑提取類胡蘿卜素的研究結果存在差異。鑒于研究材料和方法的不同，研究者所選用的提取溶劑也不盡相同。朱建飛等[10]用丙酮甲醇(2∶1)為提取溶劑提取紫蘇粕中的類胡蘿卜素；郭鵬飛[11]以95%乙醇作為提取溶劑，對番木瓜果肉進行類胡蘿卜素的提取；莫玉楠等[12]以丙酮乙醇(1∶1)為提取溶劑提取橙色大白菜中的類胡蘿卜素；孫明奇[13]以丙酮石油醚(2∶1)為提取溶劑，采用超聲波法提取柑橘果皮中的類胡蘿卜素；王曉璇等[14]選用乙酸乙酯和乙醇(1∶1)為提取溶劑，提取枸杞皮渣中類胡蘿卜素。筆者試驗通過選用丙酮、石油醚、甲醇等常用有機試劑的比較，認為黃花菜類胡蘿卜素的最佳提取溶劑為丙酮石油醚(1∶1)。

(2)紫外可見光所顯示的最高峰的位置、吸收光譜的形狀為類胡蘿卜素的結構解析提供了重要信息[9]。筆者試驗中不同提取溶劑下黃花菜中類胡卜素的紫外-可見光光譜吸收峰值多在在445 nm、450 nm、475和480 nm處,具有類胡蘿卜素的特征吸收值，而且與文獻中[15,16]葉黃素的吸收峰特征值相一致，說明黃花菜類胡蘿卜素組分中葉黃素的含量很高。但關于黃花菜中類胡蘿卜素的主要成分測定和分離純化還有待于進一步研究。

(3)筆者試驗以黃花菜為材料，利用單因素和正交試驗，優化其類胡蘿卜素的超聲波法提取條件，結果為用丙酮石油醚(1∶1)為提取試劑，按料液比1∶20(g·mL1-)，超聲溫度55℃，超聲時間25 min，超聲功率200 W進行超聲提取后在445 nm下測定類胡蘿卜素提取液的吸光光度值。在此條件下測得類胡蘿卜素含量為62.4 g·100 g-1，且重復性好。因此，超聲輔助工藝適用于黃花菜中類胡蘿卜素的提取，且效率高、方便快捷、綠色環保，同時也說明黃花菜是較好的類胡蘿卜素源植物。