刺五加P450基因的篩選及其表達對皂苷含量的影響

宋 鑫，崔明暉，張朵朵，張 杰，林麗梅，邢朝斌

刺五加基因的篩選及其表達對皂苷含量的影響

宋 鑫，崔明暉，張朵朵，張 杰，林麗梅，邢朝斌*

華北理工大學生命科學學院，河北 唐山 063210

篩選和鑒定刺五加中的細胞色素基因（），分析其進化特征，探究其與刺五加總皂苷含量的相關性。根據轉錄組測序結果，篩選得到基因，并對其進行生物信息學分析與適應性進化分析，采用qRT-PCR法檢測基因的表達量，采用分光光度計測定刺五加的總皂苷含量。篩選得到了18條基因。刺五加P450蛋白不存在跨膜區域，二級結構以α-螺旋和無規則卷曲結構為主。基因不存在正選擇位點。各間的表達量差異顯著，部分基因表達量差值在10倍以上，7條基因的表達與皂苷含量呈正相關關系（＜0.05）。鑒定出與刺五加總皂苷含量存在正相關關系的基因，基因在進化中受到純凈選擇。

刺五加；細胞色素；生物信息學分析；基因表達量；qRT-PCR

刺五加(Rupr. et Maxim.) Maxim.是我國珍貴藥用植物，具有抗疲勞、抗缺氧、抗腫瘤等許多藥理作用，與人參一樣，被廣泛用作“適應原”樣藥物[1]，三萜類化合物是其主要活性成分之一。三萜皂苷類化合物在生物體中均需通過依賴甲羥戊酸的類異戊二烯途徑進行合成[2]，合成過程分為前體形成、骨架構建以及后修飾3個階段。其中，后修飾過程是決定形成何種皂苷和其產量的關鍵環節，細胞色素P450（cyctochrome P450 enzyme，P450）即在此過程中負責三萜烯骨架的羥基化、氧化和糖基化等復雜的后修飾作用，是三萜皂苷類化合物生物合成中的關鍵酶[3]。

P450是第一組被歸類于“超級家族”的酶類，在動植物、細菌和真菌等細胞中廣泛分布[4]，它是自然界中最大且最古老的家族。自從1958年從小鼠肝臟微粒體中分離到第一個細胞色素P450，以及1989年從鱷梨Mill.中克隆出第1個植物基因序列[5]以來，基因就因其多樣化的功能成為了研究熱點。在植物中，P450主要參與植物體內初級和次級代謝反應，并發揮重要的催化作用[6]。迄今為止，利用功能缺失突變體法、差異篩選法、抗體或探選cDNA文庫、同源序列法等方法已成功地分離了多個基因，部分基因功能已經被鑒定[7]。Vasav等[8]在番茄中鑒定出233個基因以及保守基序并進行了系統進化分析，為番茄中基因家族的功能和進化提供具有重要價值的信息。

本研究通過刺五加轉錄組測序數據篩選刺五加（）基因，利用BLAST工具對其序列進行分析和鑒定，同時利用生物信息學方法來進行分析，通過qRT-PCR分析基因的表達量與皂苷含量間的相關性，為進一步研究刺五加藥用成分生物合成機理奠定基礎。為三萜生物合成途徑的進一步解析與P450的功能研究提供借鑒。

1 材料與儀器

1.1 材料

刺五加樣本采自河北省承德市霧靈山國家級自然保護區，經華北理工大學邢朝斌教授鑒定為五加科植物刺五加(Rupr. et Maxim) Maxim.。選取刺五加植株的葉片，經清水洗凈、濾紙吸干水分保存于?80 ℃，用作后續提取刺五加總RNA和測定總皂苷含量的樣本，根據總皂苷含量差異篩選4株同一產地、三年生、長勢相似的刺五加樣本（A、B、C、D），進行后續轉錄本測序。

1.2 儀器

核酸定量儀（NanoDrop One，Thermo Fisher Scientific）；7900HT型實時熒光定量PCR系統（Thenmo scientific）；AC2-s型無菌操作臺（ESCO公司）；3K15型冷凍高速離心機（Sigma公司）；PCR擴增儀（ProFlex PCR System，Life technologies）；核酸電泳儀、DYY-12型水平電泳槽（北京市六一儀器廠）；C300型凝膠成像儀（Azure biosystems）；2ZX-2型旋片式真空泵（臨海市譚氏真空設備有限公司）；V-5100B型可見光光度計（上海元析儀器有限公司）。

2 方法

2.1 EsP450基因的篩選及生物信息學分析

使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取和純化刺五加葉片總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測所提取總RNA的完整性，并將其逆轉錄為cDNA，構建cDNA文庫，進行高通量測序。經過轉錄組拼接、組裝與功能注釋后，獲得unigene的注釋信息[9]。

根據unigene注釋信息篩選出刺五加轉錄組測序數據中的，通過BLAST比對和人工鑒定，最終得到18條基因。使用ExPASy中的Protparam預測蛋白質氨基酸數量、相對分子質量、理論等電點（PI）等蛋白質基本性質。在NCBI中的Conserved Domain Database在線軟件中分析蛋白質結構功能域。通過TMHMM Server（v2.0）軟件對蛋白質跨膜結構進行預測。在TargetP 1.1 Sever軟件中分析蛋白質亞細胞定位，Singalp 3.0 Sever進行信號肽的預測，使用SOPMA軟件對蛋白質二級結構進行預測。之后使用SWISS-MODEL進行蛋白質三級結構的預測。最后，在MEGA7.0軟件中使用鄰位相連法（neighbor-joining）構建基因的系統進化樹

2.2 進化分析與正選擇位點的確定

通過Clustal X軟件進行多序列比對，采用MEGA7.0軟件中的臨近法，bootst rap值設為1000，構建系統發育樹。通過分析系統發育關系，進行適應性進化分析，在分子水平上度量選擇壓力時，可通過估算核苷酸序列非同義替換率（N）與同義替換率（S）的比值（）來推測出其進化趨勢與所經受的選擇壓力。當N＝S，即＝1表現為中性選擇；當N＜S，即＜1，表明受到負選擇；當N＞S，即＞1，表明出現了正選擇，若顯著大于1可被視為蛋白質發生適應性進化的證據[10]。使用PAML軟件中的Comdelc程序的位點模型對刺五加的基因在進化過程中所受到的選擇壓力進行分析。

位點模型假設不同位點的值不同，但進化樹上各分支值相同。本研究采用M1a（近中性）對M2a（正選擇），M0（單一比值）對M3（離散）和M7（beta）對M8（beta&）3對模型進行LRT檢驗來驗證模型之間是否存在差異。其中M0（單一比值）對M3（離散）的比較是為了驗證不同位點的值是否不同，M7（beta）對M8（beta&ω）易出現假陽性結果，所以選擇M1a（近中性）對M2a的檢測結果為可能的正選擇位點[10]。并將序列數據提交到Datamonkey（http://www. datamonkey.org/）和MEC（http:// selecton. tau.ac.il/）。使用Datamonkey Web服務器中的固定效應似然模型（fixed effects likelihood model，FEL）和單一似然祖先計數法（single likelihood ancestor counting，SLAC）對位點的選擇壓力進行在線分析，對于SLAC、FEL方法而言，處于＜0.1水平的位點即可認為是受正選擇的影響[10]。

2.3 差異表達基因的篩選

使用RSEM得到每個樣品比對到每個基因上的read count數目，以FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）來確定每個基因的表達水平。接著，使用EBSeq進行差異分析，將FDR＜0.01且|log2(FC)|≥1作為篩選基因表達出現顯著差異的標準，Fold Change表示2樣品（組）間表達量的比值，錯誤發現率（false discovery rate，FDR）是通過對差異顯著性值進行校正得到的。

2.4 基因表達量的測定

以“2.1”項中的cDNA作為qRT-PCR模板，以刺五加基因為內參基因，并對篩選得到的9條差異表達的基因，設計qRT-PCR的特異性擴增引物（表1）。進行qRT-PCR反應，每個樣本重復3次。總反應體系為10 μL，上、下游引物各0.3 μL，cDNA模板0.5 μL，50×ROX Reference Dye 1 μL，RNase-Free ddH2O 2.9 μL，2×Talent qPCR PreMix 5 μL。反應條件：預變性95 ℃，3 min；變性95 ℃，5 s；退火55 ℃，10s；延伸72 ℃，15s，共40個循環。基于2?ΔΔCt方法計算各樣本中的基因相對表達量。

表1 EsP450基因及GAPDH基因qRT-PCR的引物序列

2.5 皂苷含量的測定及相關性分析

參考文獻的方法[11]，對樣品進行烘干、研末、稱重、乙醇溶解超聲破碎提取后，進行石油醚除色素，正丁醇萃取，通過香草醛-濃硫酸顯色法在543 nm的波長下測得其吸光度后，將其帶入齊墩果酸標準曲線（=0.185 6－0.011 7，2=0.996 4）進行重復多次計算，得到刺五加樣本總皂苷含量。使用SPSS 18.0軟件分析基因表達量與皂苷含量間的相關性。

3 結果與分析

3.1 P450基因鑒定及其蛋白理化性質

篩選轉錄組測序數據獲得的刺五加unigenes，將其中標記為基因的序列調出，與NCBI數據庫進行逐一比對，之后借助Pfam數據庫進行功能結構域的鑒定，最終確定其中存在18條，其中TRINITY_DN41836_c0_g1、TRINITY_ DN5264_ c0_g2、TRINITY_DN10211_c0_g2和TRINITY_ DN1308_c0_g1均缺少了編碼蛋白質的核酸序列，推測為轉錄組拼接過程中丟失了前端部分序列，其余14條基因具有完整的開放閱讀框。

EsP450蛋白的理化性質分析結果表明（表2），各EsP450的長度、等電點方面有很大差異。編碼的氨基酸長度在122～746 aa；相對分子質量介于13 629.50～83 620.79；等電點在5.78～9.55，堿性蛋白占據多數，共12個，酸性蛋白共6個；不穩定系數介于31.88～64.80，平均值為42.22，總體上穩定性較差；脂溶指數在83.09～102.21，平均值為95.21，親水系數均為負值，因此推測EsP450蛋白為親脂性蛋白質。

表2 刺五加P450蛋白的基本理化特性

3.2 P450蛋白二級結構及亞細胞定位分析

在刺五加P450蛋白二級結構（表3）中，α-螺旋（23.77%～54.35%）＞無規則卷曲（31.79%～49.18%）＞延伸鏈（9.24%～18.03%）＞β-轉角（3.24%～9.02%）。因此推測二級結構中起關鍵作用的是α-螺旋。信號肽預測結果表明，P450蛋白中含有信號肽的可能性較小，推測為胞內蛋白。亞細胞定位結果分析，1個位于細胞核，1個位于線粒體，2個位于質膜，1個位于葉綠體類囊體膜，5個位于過氧化物酶體，8個位于內質網膜，推測P450蛋白在不同的位置實現氧化功能。

3.3 保守結構域分析

為了進一步探索的功能作用和進化關系，使用篩選出的18條以及來自擬南芥的52條的氨基酸序列，利用MEGA7.0軟件構建了P450的ML系統發育樹（圖1）。如圖1所示，分別屬于不同家族。其中，CYP72家族與CYP82家族各有3條；CYP81家族與CYP94家族各有1條為TRINITY_DN4544_c0_g1和TRINITY_DN6616_c0_ g1；而刺五加P450基因并未分布在CYP70家族和CYP76家族中；而4條（TRINITY_DN11618_c0_g1、TRINITY_DN3437_c0_g1、TRINITY_DN1436_c0_g1、TRINITY_DN3773_c0_g1）序列與代表序列的同源性過小，因此無法歸屬；其余序列全部分布在多基因簇CYP71家族中。根據刺五加核苷酸序列，使用鄰位相連法再次進行了系統發育進化樹的構建（圖2），未鑒定出所在家族的4條基因，經過BLAST比對與基因結構分析后，確認TRINITY_DN3437_c0_g1、TRINITY_DN1436_c0_g1和TRINITY_DN3773_c0_g1屬于CYP71家族，TRINITY_DN11618_c0_g1，除了dnak保守結構域外，還包含了CYP71家族保守基序，因此將其歸屬為CYP71家族。

表3 刺五加P450蛋白二級結構及亞細胞定位

紅星為刺五加中的P450基因

在進行保守結構域分析時發現（圖2），基因的motif中存在典型的保守結構域。這些典型的保守結構域主要包括PERF結構域（PXRX）、K螺旋（EXXR）和C末端的血紅素結合域（FXXGXXXCXG）。血紅素結合域存在鐵元素形成硫醇鹽離子鍵的絕對保守的半胱氨酸殘基，該結構域也是P450蛋白的特征結構，其中，血紅素結合域存在于motif 1，PERF結構域存在于motif 7，K螺旋存在于motif 5。在全部序列中均較測到了motif 1與motif 7，除TRINITY_DN41836_c0_g1外，其他序列還共同擁有motif 3。但K螺旋所在的motif 5只存在于分支Ⅱ全部序列、分支Ⅰ除TRINITY_DN41836_c0_g1外全部序列、以及TRINITY_DN1051_c3_g1、TRINITY_DN6616_c0_ g1中，在進行多序列比對確認后，發現K螺旋確實存在于除TRINITY_DN41836_c0_g1外全部序列，而TRINITY_DN41836_c0_g1轉錄本序列為934 bp，但其編碼形成的多肽鏈僅有122 aa，因此推測為在轉錄組拼接時出現了丟失，從而證實了篩選得到的P450真實性。

A-P450基因序列構建的系統發育進化樹 B-motif C-domain

3.4 選擇壓力分析

利用PLAM軟件中的Comedlc程序檢測EsP450家族中的每個位點的選擇壓力（表4）。單比率模型M0的參數np＝35，似然值ln＝?4 587.954 733；離散模型M3的參數np＝39，似然值ln＝?4 519.625 208，兩者之間的LRT檢驗＜0.001。備擇假設模型M3成立，M3優于M0，說明各個位點存在選擇嚴壓力的差異。M3的2小于1，說明不存在正選擇位點。模型M1a與M2a的2Δln＝0，＝1，說明備擇假設M2a不成立。在模型M7與M8比較中，df＝2，2Δln＝0.198 608，得到＝0.905 07，說明模型M8不成立基于Datamonkey檢測選擇壓力：分別以SLAC模型與IFEL模型進行正選擇位點的鑒定。SLAC模型在＜0.1水平下檢測到6個（2E、34K、64K、125R、223L、334E）正選擇位點，14個負選擇位點；在＜0.05水平下，檢測到5個（160K、254E、308A、356H、437K）負選擇位點，未檢測到正選擇位點；在＜0.01水平下未檢測到選擇位點。在IFEL模型中，當＜0.1時檢測到3個（13L、26K、45G）正選擇位點，19個負選擇位點；在＜0.01水平下檢測到2個（197F、310D）正選擇位點，6個（33K、171V、256K、343L、353L、380E）負選擇位點。

將刺五加18條基因序列上傳至在線服務器MEC內，以Clustal W為對比方法，于TRINITY_DN11618_c0_g1一級結構上標注選擇壓力（圖3）。絕大部分的位點被標注為紫色，其中深紫色位點有150個，占總位點的20.1%。不存在橙色標記與黃色標記。表明了純凈選擇在基因家族的進化過程中占主導地位。

表4 刺五加P450基因基于PAML軟件的適應性分析

黃色代表受到正選擇的位點，白色代表受到中性選擇，紅色代表受到負選擇的位點，顏色越深代表在統計學上的顯著性越強

3.5 基因相對表達量與皂苷含量

從18條基因中篩選得到9條差異表達基因，對它們進行qRT-PCR驗證的結果顯示，qRT-PCR得到的在各個樣品中的表達量與轉錄組結果基本一致（＜0.05）。TRINITY_ DN41836_c0_g1在樣本D中表達量最高，是樣本C中表達量的19.5倍；TRINITY_DN6616_c0_g1在各樣本中表達量均較低，其中在樣本A中未檢測到其表達。4個樣本中總皂苷的含量從高到低依次為D（47.2 g/kg）＞C（37.6 g/kg）＞B（32.2 g/kg）＞A（26.1 g/kg）。使用SPSS軟件對基因表達量與總皂苷含量進行相關性分析。結果顯示，在0.01級別檢測到了6條基因與總皂苷含量相關性顯著；在0.05級別檢測到了TRINITY_DN41836_c0_g1與總皂苷含量相關性顯著；TRINITY_DN39772_c0_g3和TRINITY_ DN5264_c0_g2與總皂苷含量不存在相關性。見圖4。

4 討論

三萜皂苷是許多藥用植物的主要活性成分之一，基因的表達水平影響了三萜皂苷在藥用植物中合成和積累量的多寡[11]。本研究從刺五加轉錄組數據中挖掘出了基因家族成員，對其進行了系統的生物信息學分析。研究結果表明，CYP450蛋白二級結構以α-螺旋和無規則卷曲結構為主，延伸鏈和β-轉角相對較少，推測α-螺旋和無規則卷曲在其蛋白二級結構中發揮著重要的作用。細胞定位分析結果顯示不同的CYP450定位在不同的細胞器中實現其氧化功能，這與前人研究結果一致[12]。基因家族分析的結果顯示，所在家族與已知和三萜結構修飾有關的分布家族基本吻合[13]。在刺五加中存在的最大類型是CYP71。CYP71也是植物中最大的基因簇，這個基因簇基本上包含超過半數基因，功能非常豐富[14]，此家族中的CYP716A47和CYP716A53v2已被證實參與人參皂苷生物合成過程中2步連續的氧化反應[15]，而刺五加與人參同屬五加科，是人參的近源物種，在刺五加CYP71家族中很可能存在參與三萜皂苷合成途徑反應的CYP450。

A～D分別代表4株刺五加樣本 1-TRINITY_DN10211_c0_g2 2-TRINITY_DN1436_c0_g1 3-TRINITY_DN1439_c0_g1 4-TRINITY_ DN3773_c0_g1 5-TRINITY_DN39772_c0_g3 6-TRINITY_DN41836_c0_g1 7-TRINITY_DN4544_c0_g1 8-TRINITY_DN5264_c0_g2 9-TRINITY_DN6616_c0_g1

氨基酸序列的適應性進化能夠為研究酶的活性位點和功能提供有意義的信息。在植物眾多的P450中，部分為三萜皂苷生物合成通路中的關鍵酶，這些酶也是造成三萜苷元多樣性的重要原因之一。利用分子適應性進化原理進行功能位點的篩選可以為植物P450的活性位點提供有價值的參考。本研究通過PAML、MEC模型、Datamonkey共3種方式對進行了分析，結果表明不存在正選擇位點，由此推測基因以負選擇為主導，它們受到強烈的負選擇作用的約束，在長期進化的過程中高度保守，對維持基因的重要功能起到了保護作用。比如，維持蛋白質結構的位點一般都受負選擇，因為它們一旦發生突變，就會被純化處理而消失[16]。

本研究所用的不同刺五加樣本皂苷含量存在顯著差異，并且9條差異表達基因中，有7條基因的表達量與刺五加總皂苷含量成正相關關系（＜0.05）。吳鵬等[3]研究結果也表明，基因表達量與三萜皂苷含量間確實存在正相關關系，這代表參與刺五加三萜皂苷合成途徑的很可能存在于本研究篩選得到的7條差異基因中。目前預測P450的功能仍具有一定難度，今后可以對這7條基因進行深入挖掘，開展基因克隆及功能研究，為進一步解析三萜皂苷合成途徑提供借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification ofgene ofand its effect on saponin content

SONG Xin, CUI Ming-hui, ZHANG Duo-duo, ZHANG Jie, LIN Li-mei, XING Zhao-bin

College of Life Science, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China

To screen and identifygene in(), analyze its evolutionary characteristics, and explore the correlation betweengene and total saponins content of.According to the results of transcriptome sequencing,was screened and analyzed by bioinformatics and adaptive evolution, qRT-PCR was used to detect the expression ofand spectrophotometer was used to determine the total saponin content of.Eighteenwere screened. There was no transmembrane region in, and the secondary structure was mainly α-helix and irregular curly structure. There was no positive selection site of. The expression ofwas significantly different. Sevenwere identified, which were positively correlated with the total saponin content (＜0.05).Thewere subjected to purifying selection pressure during evolution.

(Rupr.et Maxim) Maxim; cytochrome P450; bioinformatics analysis; gene expression level; qRT-PCR

R282.12

A

0253 - 2670(2021)16 - 5012 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.026

2021-01-23

河北省自然科學基金生物醫藥聯合基金項目（H2020209302）；河北省教育廳資助科研項目（ZD2019075）；國家自然科學基金項目（31570683）；河北省大學生創新創業訓練計劃（S202010081016）；華北理工大學大學生創新創業訓練計劃（R2020044）；河北省大中學生科技創新能力培育專項項目（2021H020911）

宋 鑫（2000—），男，研究方向為生物信息在藥用植物中的應用。

邢朝斌（1975—），男，教授，研究方向為分子生藥學。Tel/Fax: (0315)8805590 E-mail: xingzhb@ncst.edu.cn

[責任編輯 時圣明]