基于IL-6/JAK2/STAT3通路探討補腎化痰方改善去勢大鼠骨丟失的作用機制

譚張奎，向 楠，張 妍，熊夢欣，薛瑤珺，黃詩怡，周廣文

基于IL-6/JAK2/STAT3通路探討補腎化痰方改善去勢大鼠骨丟失的作用機制

譚張奎1，向 楠2，張 妍1，熊夢欣1，薛瑤珺1，黃詩怡1，周廣文3*

1. 湖北中醫藥大學中醫臨床學院，湖北 武漢 430065 2. 湖北中醫藥大學第一臨床學院，湖北 武漢 430065 3. 湖北中醫藥大學針灸骨傷學院，湖北 武漢 430065

探究補腎化痰方對去勢大鼠骨丟失和IL-6/Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉導與轉錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）通路的影響。SD雌性大鼠隨機分為對照組、模型組、戊酸雌二醇（0.184 mg/kg）組以及補腎化痰方低、中、高劑量（4.7、9.4、18.8 g/kg）組，除對照組外，其他組均采用手術切除卵巢，制作絕經后骨質疏松癥模型。術后1周給予戊酸雌二醇和補腎化痰方進行干預，給藥12周后取材。采用Micro CT檢測各組大鼠肱骨骨密度和骨礦物質含量；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察各組大鼠股骨組織病理變化；采用堿性磷酸酶染色法考察各組大鼠骨髓成骨細胞數量；采用ELISA法檢測各組大鼠血清中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-17水平；采用qRT-PCR法檢測各組大鼠股骨組織、、和mRNA表達情況；采用Western blotting法檢測各組大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達情況。與對照組比較，模型組大鼠肱骨骨密度和骨礦物質含量顯著降低（＜0.01）；骨小梁減少、稀疏，脂肪細胞增多；血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平顯著升高（＜0.01）；股骨組織、、和mRNA表達水平顯著升高（＜0.01）；IL-6、IL-6R、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，各給藥組骨密度和骨礦物質含量顯著增加（＜0.05、0.01）；骨小梁增多，且結構較完整，脂肪細胞減少；補腎化痰方中、高劑量組大鼠骨髓成骨細胞數顯著增多（＜0.05、0.01）；各給藥組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平顯著降低（＜0.01），戊酸雌二醇組以及補腎化痰方中、高劑量組大鼠血清中IL-17水平顯著降低（＜0.01）；股骨組織、、和mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），IL-6、IL-6R、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平顯著降低（＜0.01）。補腎化痰方能夠改善去勢大鼠骨丟失，其機制可能與抑制IL-6/JAK2/STAT3通路有關。

補腎化痰方；骨丟失；絕經后骨質疏松癥；去勢大鼠；IL-6/JAK2/STAT3通路

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指絕經后女性卵巢功能衰退且雌激素水平降低，骨形成減少，骨吸收增強，骨吸收大于骨形成失去平衡，出現以骨量減少、骨強度降低、骨顯微結構退變、骨脆性增加為特征的一種代謝性骨疾病[1]，臨床上常表現為骨痛、脊柱變形甚至骨折等。據我國最新的骨質疏松癥（osteoporosis，OP）流行病學調查顯示，50歲以上和65歲以上人群OP患病率分別為19.2%、32.0%。隨著我國人口老齡化日益嚴重，低骨量人群即OP的高危人群數量逐年上升，50歲以上人群低骨量率為46.4%，且PMOP患病率顯著高于歐美國家[2]。目前治療PMOP的藥物主要有抗骨吸收劑（如雙膦酸鹽、迪諾塞麥、降鈣素、雌激素、選擇性雌激素受體調節劑）、促骨形成劑（如特立帕肽）等。

中醫將PMOP歸屬為“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇，骨碎補總黃酮、淫羊藿苷和人工虎骨粉等均具有一定的抗骨質疏松作用。湖北中醫名師向楠教授從“腎主骨生髓”的理論出發，結合多年臨床經驗，認為本病在腎精不足前提下，易滋生痰濁之邪[3-6]，提出補腎化痰的治則；并結合《本草綱目》補骨脂丸與《丹溪心法》黃瓜蔞丸加減而成補腎化痰方[7]，其臨床療效顯著。本課題組前期研究發現，補腎化痰方可以提高PMOP模型大鼠的骨密度，促進骨髓間充質干細胞成骨分化，抑制成脂分化[8-9]，改善PMOP大鼠骨免疫失衡狀態[10]，降低大鼠血清中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平[11]。研究發現，IL-6對于雌激素缺乏的小鼠骨丟失是必不可少的，表明IL-6在骨穩態中發揮著關鍵作用[12]。本研究考察補腎化痰方對去勢大鼠股骨組織IL-6/Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉導與轉錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）通路的影響，為其機制探究奠定基礎。

1 材料

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠90只，體質量（220±30）g，6月齡，購自湖北省實驗動物研究中心，動物許可證號SCXK（鄂）2015-0018。動物飼養于湖北中醫藥大學動物實驗中心，室溫（20±2）℃，光照通風適宜，自由進食飲水。動物實驗經湖北中醫藥大學實驗動物倫理審查委員會批準（批準號201909005）。

1.2 藥材

補腎化痰方由菟絲子30 g、淫羊藿10 g、補骨脂15 g、全瓜蔞15 g、紅曲12 g、凈山楂20 g組成；以上藥材采購于湖北省中醫院藥房，經湖北中醫藥大學陶春暉副教授鑒定分別為旋花科植物菟絲子Lam.的種子、箭葉淫羊藿(Sieb. et Zucc.) Maxim.的干燥葉、葫蘆科植物栝樓Maxim.的干燥成熟果實、真菌類子囊菌綱曲霉目曲霉科紅曲Went.、薔薇科植物山里紅Bge. varN. E. Br.的干燥成熟果實，均符合《中國藥典》2015年版規定。

1.3 藥品與試劑

戊酸雌二醇（批號374A，2 mg/片）購自拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司；Trizol（批號15596-026）購自美國Ambion公式；RIPA裂解液（批號P0013B）、BCA蛋白定量試劑盒（批號P0010）購自上海碧云天；HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)、5×HiScript Buffer、50×ROX Reference Dye 2（批號R101-01/02）、SYBR Green Master Mix（批號Q111-02）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；甲醇、NaCl、KCl（批號分別為10014118、10019318、10016318）購自國藥集團化學試劑有限公司；兔多抗IL-6、IL-6R、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）抗體（批號分別為Df6087、Df2530、Af6494、Af3295）購自江蘇親科生物研究中心有限公司；兔單抗JAK2、p-JAK2抗體（批號分別為3230、3776）購自美國CST公司；HRP標記的羊抗小鼠抗體、HRP標記的羊抗兔抗體、HRP標記的兔抗大鼠抗體（批號分別為BA1051、BA1054、BA1058）購自武漢博士德生物工程有限公司；大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒（批號分別為E-EL-R0019c、E-EL-R0015c）購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（批號PR1100）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 儀器

Micro CT（瑞士Scanco公司）；QuantStudioTM6型qRT-PCR儀（美國ABI公司）；JY300型水平電泳儀、JY02S型紫外分析儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；DYCZ-40型電轉儀、DYCZ-24DN型垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；HI650型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

2 方法

2.1 補腎化痰方的制備

稱取補腎化痰方全方藥材混合，加入5倍量蒸餾水浸泡2 h，先武火再文火煎1 h，濾過；重復上述步驟，再次提取濾液，合并2次濾液，采用旋轉蒸發器濃縮至最終藥物質量濃度為0.94 g/mL（以生藥量計）[10]，于4 ℃冰箱保存備用。

2.2 分組、造模與給藥

SD大鼠適應性飼養7 d后，隨機分為對照組、模型組、戊酸雌二醇（0.184 mg/kg）組以及補腎化痰方低、中、高劑量（4.7、9.4、18.8 g/kg）[13]組，每組15只。除對照組外，其他組行卵巢切除術造模，大鼠ip 1%戊巴比妥鈉（0.03 g/kg）麻醉，固定于手術操作臺，在大鼠背部正中兩側1～2 cm處行縱行切口，進入腹腔在脂肪堆積處找到卵巢，結扎并摘除雙側卵巢，分層縫合收口；對照組不摘除卵巢，只切除卵巢周圍同等質量的脂肪組織。術后大鼠im青霉素（1.6 mL/kg），1次/d，連續3 d，術后禁食不禁水1 d。戊酸雌二醇研碎后，用純凈水配制成質量濃度為0.018 4 mg/mL的混懸液，術后1周各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續12周。

2.3 標本采集與處理

給藥結束后，大鼠ip 1%戊巴比妥鈉麻醉，采用負壓采血管于腹主動脈采血，3000 r/min離心20 min，取上層血清，于?80 ℃保存備用。分離肱骨及股骨，清除肌肉組織與結締組織。骨組織一部分采用4%多聚甲醛固定用于染色及骨密度檢測，一部分用紗布包裹于?80 ℃保存用于后續檢測。用于染色的骨組織在染色前，將骨組織從4%多聚甲醛中取出，于15倍量10% EDTA脫鈣液中脫鈣處理4周，每3天更換1次脫鈣液，至骨組織變軟（以使用針扎骨組織能夠順利刺入為驗證），脫鈣后以蒸餾水清洗，于乙醇溶液中固定。

2.4 補腎化痰方對去勢大鼠肱骨微結構、骨密度及骨礦含量的影響

解凍肱骨樣本，將組織固定在Micro CT載物臺上，以360°掃描角度、分辨率為14.8 μm，掃描肱骨近端獲取連續平面圖像。掃描后，選取生長板遠端1.0 mm、層厚2.0 mm的骨組織為松質骨感興趣區域進行三維重組，提取圖像信息。獲取重組圖像后，使用Micro CT自帶分析軟件進行定量分析，檢測骨密度和骨礦含量。

2.5 補腎化痰方對去勢大鼠股骨病理變化的影響

取左側股骨，以10%甲醛固定，再用20% EDTA脫鈣液進行脫鈣，然后脫水60 min；用二甲苯I和II分別處理60 min，常規浸蠟、包埋后切片（厚4 μm），進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察股骨病理變化。

2.6 補腎化痰方對去勢大鼠骨髓成骨細胞數量的影響

取出脫鈣處理的骨組織，進行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片和烤片處理，切片脫蠟，加入堿性磷酸酶染色工作液，室溫避光染色，去除工作液，以蒸餾水洗滌2次終止顯色反應；無水乙醇脫水，二甲苯透明，于通風柜中風干，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察，各組每張切片隨機挑選6個視野進行拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件計數每個視野下的骨髓成骨細胞并取平均值。

2.7 補腎化痰方對去勢大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平的影響

取制備好的血清樣本，按ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平。

2.8 補腎化痰方對去勢大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2和STAT3 mRNA表達的影響

取新鮮冰凍骨組織組織，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

2.9 補腎化痰方對去勢大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達的影響

股骨剪碎后，加入RIPA裂解液提取蛋白，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，分別加入IL-6、IL-6R、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗體（1∶1000）和β-actin抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌5次，5 min/次，加入HRP標記的抗體（1∶50 000），室溫孵育2 h，TBST洗滌后，加入ECL發光液，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片，采用BandScan軟件分析膠片灰度值。

表1 引物序列

2.10 統計學方法

3 結果

3.1 補腎化痰方對去勢大鼠肱骨微結構、骨密度及骨礦含量的影響

如圖1所示，與對照組相比，模型組大鼠肱骨皮質骨變薄，骨小梁稀疏、減少；與模型組相比，各給藥組大鼠肱骨骨小梁增多，結構較完整。如圖2所示，與對照組比較，模型組骨密度和骨礦含量顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組骨密度和骨礦含量顯著增加（＜0.05、0.01）。

3.2 補腎化痰方對去勢大鼠股骨病理變化的影響

如圖3所示，對照組骨小梁結構均勻，形態結構完整，骨髓腔相對較小；與對照組比較，模型組骨小梁數目減少、稀疏，骨小梁間隙增大，骨髓腔明顯增寬，脂肪空泡多；與模型組比較，各給藥組骨小梁數量稍增加，排列尚整齊，骨髓脂肪組織減少。

圖1 補腎化痰方對去勢大鼠肱骨微結構的影響

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同

圖3 補腎化痰方對去勢大鼠股骨病理變化的影響 (HE，×100)

3.3 補腎化痰方對去勢大鼠骨髓成骨細胞數量的影響

堿性磷酸酶染色后骨髓成骨細胞呈藍紫色。如圖4所示，與模型組比較，補腎化痰方中、高劑量組大鼠骨髓成骨細胞數顯著增多（＜0.05、0.01）。

3.4 補腎化痰方對去勢大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平顯著降低（＜0.01），戊酸雌二醇組以及補腎化痰方中、高劑量組大鼠血清中IL-17水平顯著降低（＜0.01）。

箭頭表示骨髓成骨細胞

3.5 補腎化痰方對去勢大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2和STAT3 mRNA表達的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠股骨組織、、和mRNA表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠股骨組織、、和mRNA表達水平均顯著降低（＜0.01）。

圖5 補腎化痰方對去勢大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平的影響(, n = 10)

圖6 補腎化痰方對去勢大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2和STAT3 mRNA表達的影響(, n = 10)

3.6 補腎化痰方對去勢大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01），戊酸雌二醇組以及補腎化痰方中、高劑量組p-JAK2/JAK2顯著降低（＜0.05、0.01），戊酸雌二醇組以及補腎化痰方高劑量組p-STAT3/STAT3顯著降低（＜0.05）。

圖7 補腎化痰方對去勢大鼠股骨組織IL-6/JAK2/STAT3通路相關蛋白表達的影響(, n = 10)

4 討論

PMOP主要是由于女性絕經后卵巢功能衰退，雌激素水平降低，對破骨細胞的抑制作用減弱，破骨細胞的數量增加、凋亡減少而壽命延長，導致其骨吸收功能增強。雖然成骨細胞介導的骨形成亦有增加，但不足以代償過度骨吸收，這與本次關于成骨細胞數量研究相符合。骨重建活躍和失衡致使小梁骨變細或斷裂，皮質骨孔隙度增加，導致骨強度下降。雌激素減少降低骨骼對力學刺激的敏感性，使骨骼呈現類似于廢用性骨丟失的病理變化[13]。中醫學文獻中無PMOP之名，按其主要臨床表現，對應中醫相近的病癥，可以歸屬于以下幾類：對于臨床表現不明顯，或僅感覺腰背酸軟乏力的OP患者，如“腰背不舉，骨枯而髓減”，歸屬于骨痿；對于臨床有腰背疼痛沉重患者，如“腰背疼痛，全身骨痛，身重、四肢沉重難舉”，可歸屬于骨痹。根據中醫藥“腎主骨生髓”“脾主四肢肌肉”及“不通則痛”的理論，以補腎益精、健脾益氣、活血祛瘀為OP的主要治法。向楠教授在此基礎上，根據“腎虛水泛為痰”結合現代研究骨髓間充質干細胞在OP狀態下成脂分化，提出了“補腎化痰”的新治法。

《本草綱目》中補骨脂丸記載：“補骨脂4兩（炒香），菟絲子4兩（酒蒸），胡桃肉1兩（去皮），乳香2錢半，沒藥2錢半，沉香2錢半；主治壯筋骨，益元氣”。《丹溪心法》中黃瓜蔞丸記載：“栝蔞仁、半夏、山楂、神曲（炒，各等分），治食積，痰壅滯”。補腎化痰方是從補骨脂丸中選取補骨脂、菟絲子加淫羊藿，從黃瓜蔞丸選取瓜蔞，山楂，改神曲為紅曲，2方融合而成，方中淫羊藿與補骨脂合用，同為君藥，具益腎壯陽、強筋健骨的功效；菟絲子滋補肝腎、固精縮尿，全瓜蔞清熱化痰，共為臣藥；山楂善于消食化積、行氣散瘀；紅曲長于健脾消食、活血化瘀，2藥協同為佐藥，全方共奏補腎益髓、化痰調脂之功。淫羊藿苷是中藥淫羊藿的主要藥效成分，可有效預防骨質疏松癥[14-15]。補骨脂素與異補骨脂素均為補骨脂中的主要有效成分，具有多種生物活性，對骨質疏松癥有很好的治療作用[16-18]。菟絲子主要活性成分為黃酮類化合物，山柰酚和金絲桃苷為其提取物中發揮成骨作用的活性成分，可用于治療骨質疏松癥[19-20]。山楂、瓜蔞、紅曲提取物可調脂抗炎[21-22]。紅曲能夠促進大鼠骨形成，其提取物含輔酶Q10和洛伐他汀，能夠改善骨質疏松癥[23-24]。

PMOP被認為是炎性疾病，甚至是一種自身免疫狀態。絕經后雌激素缺乏及T細胞免疫功能減退可引起血清IL-6、TNF-α等細胞因子水平上升[25]。IL-6和TNF-α可作用于破骨細胞，刺激骨吸收作用；同時還能增加骨膠原酶分泌，促進骨基質降解而影響成骨細胞活性，進而影響骨形成作用，因此被稱為溶骨性細胞因子[26]。IL-6的受體由特異性的IL-6結合蛋白（IL-6受體）和糖蛋白130（gp130）2部分組成。gp130是一種激活蛋白，是許多IL-6家族細胞因子共同的受體。可溶性IL-6受體與IL-6結合后，激活含有gp130信號肽的細胞[27]。在骨髓中，IL-6首先與靶細胞膜上IL-6特異性受體結構鏈即IL-6R結合形成復合物，再與IL-6受體信號傳導鏈即gp130相關聯后，促使其二聚化。胞內JAK2通過FERM結構域與IL-6特異性受體（IL-6R/gp130）相結合并被磷酸化激活，進一步磷酸化STAT3，活化的STAT3形成二聚體并暴露其核定位信號，從而由胞質轉移到胞核，啟動下游轉錄因子RORγt和RORα的表達來影響Th17細胞的分化[28]。骨髓中Th17細胞數量增加，并分泌高水平的IL-17、TNF-α。而骨微環境IL-17水平的提高，可直接誘導成骨細胞和骨髓基質細胞表達核轉錄因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligands，RANKL）、核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）易位，從而促進破骨細胞成熟和骨吸收。IL-17及TNF-α作為促炎因子，其釋放又會進一步加重機體炎性反應。研究發現，用IL-6/sIL-6R處理成骨細胞可以誘導RANKL產生，從而刺激破骨細胞形成和骨吸收，而STAT3信號通路介導了這一生物學過程[29]。可見在骨髓中，炎性因子通過IL-6/JAK2/STAT3信號通路介導Th17細胞活化，引發炎性級聯反應，最終導致破骨細胞活性增強，骨吸收增加，導致PMOP的發生與發展。

本研究發現，模型組骨小梁稀疏，結構破壞，骨髓脂肪細胞增多，骨密度降低；補腎化痰方能夠顯著提高模型大鼠骨密度，改善骨小梁形態，降低脂肪細胞數，增加成骨細胞數。研究發現[30-32]，痰濁證患者炎性因子IL-6、TNF-α水平升高，給予中藥化痰濁后IL-6、TNF-α水平顯著降低，表明炎性反應與痰濁關系密切。而采用補腎法治療腎虛夾痰證患者，發現相關炎性因子水平降低，表明腎虛與痰濁存在聯系[33]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平顯著升高，表明去勢大鼠血清中出現炎性反應；進一步在骨組織發現、mRNA和蛋白表達水平顯著升高，表明骨組織同樣有炎性反應。骨組織中JAK2、STAT3 mRNA及p-JAK2、p-STAT3蛋白表達水平顯著升高，表明IL-6/JAK2/STAT3信號通路被激活；補腎化痰方干預后血清炎性因子水平降低，骨組織IL-6/JAK2/STAT3通路相關蛋白mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，大鼠骨丟失改善，表明其作用機制可能與抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路有關。本課題組前期研究發現，補腎化痰方能夠降低骨髓中Th17數量[10]，其與IL-6水平的降低及IL-6/JAK2/ STAT3信號通路的關系仍有待進一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Bushen Huatan Recipe on improving bone loss of ovariectomized rats based on IL-6/JAK2/STAT3 pathway

TAN Zhang-kui1, XIANG Nan2, ZHANG Yan1, XIONG Meng-xin1, XUE Yao-jun1, HUANG Shi-yi1, ZHOU Guang-wen3

1. Clinical College of Traditional Chinese Medicine, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 2. The First Clinical College, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 3. College of Acupuncture and Orthopedics, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430065, China

To explore the effect of Bushen Huatan Recipe (補腎化痰方) on bone loss and IL-6/Janus kinase 2 (JAK2)/signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3) pathway in ovariectomized rats.SD female rats were randomly divided into control group, model group, estradiol valerate (0.184 mg/kg) group, low-, medium- and high-dose (4.7, 9.4, 18.8 g/kg) Bushen Huatan Recipe groups. Except for control group, the ovaries of all other groups were surgically removed to make a postmenopausal osteoporosis model. One week after operation, estradiol valerate and Bushen Huatan Recipe were given for intervention, and samples were obtained 12 weeks after administration. Micro CT was used to detect humerus bone mineral density and bone mineral content of rats in each group; Hematoxylin-eosin (HE) staining method was used to observe the pathological changes of femur of rats in each group; Alkaline phosphatase staining method was used to examine the number of osteoblasts in rats of each group; ELISA method was used to detect the levels of interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and IL-17 in serum of rats in each group; qRT-PCR method was used to detect,,andmRNA expressions in femur of rats in each group; Western blotting method was used to detect IL-6, IL-6R, JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 protein expressions in femur of rats in each group.Compared with control group, the bone mineral density and bone mineral content of humerus in model group were significantly reduced (< 0.01); Bone trabecula was reduced and sparse, and fat cells were increased; Levels of IL-6, TNF-α and IL-17 in serum were significantly increased (< 0.01);,,andmRNA expressions of femur were significantly increased (< 0.01); IL-6, IL-6R, p-JAK2 and p-STAT3 protein expressions were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, the bone mineral density and bone mineral content of rats in each treatment group were significantly increased (< 0.05, 0.01); Bone trabecula were increased, structure was more complete, and fat cells were decreased; Number of bone marrow osteoblasts in rats of medium- and high-dose Bushen Huatan Recipe groups were significantly increased (< 0.05, 0.01); Levels of IL-6 and TNF-α in serum of rats in each administration group were significantly reduced (< 0.01), IL-17 level in serum of rats in estradiol valerate group and medium-, high-dose Bushen Huatan Recipe groups were significantly reduced (< 0.01);,,andmRNA expressions of femur were significantly reduced (< 0.01), IL-6, IL-6R, p-JAK2 and p-STAT3 protein expressions were significantly reduced (< 0.01).Bushen Huatan Recipe can improve bone loss in ovariectomized rats, and its mechanism may be related to the inhibition of IL-6/JAK2/STAT3 pathway.

Bushen Huatan recipe; bone loss; postmenopausal osteoporosis; ovariectomized rats; IL-6/JAK2/STAT3 pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2021)16 - 4904 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.015

2021-03-31

國家自然科學基金面上項目（82074416）；國家自然科學基金青年科學基金資助項目（81904267）；湖北省自然科學基金資助項目（2019CFB232）；武漢市衛生健康委員會武漢市醫學科研項目（WZ19Q03，WZ20C28）；湖北中醫名師向楠工作室建設項目（鄂衛生計生通報[2018]15號）

譚張奎（1990—），男，博士研究生，研究方向為中醫藥防治內分泌疾病。Tel: 13545072800 E-mail: tzhongkui@163.com

周廣文（1987—），女，講師，主治醫師，博士，研究方向為中醫藥防治骨代謝相關疾病及退行性骨病的研究。Tel: 15827547190 E-mail: 609053257@qq.com

[責任編輯 李亞楠]