基于miR-34調控KLF4/VEGF傳導軸探討活血榮絡方促腦梗死后血管新生的機制

楊仁義，顏思陽，周德生，傅馨瑩，馬 強，張宇星，高曉峰，劉利娟*

? 藥理與臨床 ?

基于miR-34調控KLF4/VEGF傳導軸探討活血榮絡方促腦梗死后血管新生的機制

楊仁義1，顏思陽1，周德生2，傅馨瑩1，馬 強1，張宇星1，高曉峰2，劉利娟2*

1. 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208 2. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

基于miR-34家族基因與Kruppel樣因子4（Kruppel-like factor 4，KLF4）/血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）傳導軸的相關性探討活血榮絡方促腦梗死后血管新生的機制。將SD大鼠隨機分為對照組、模型組、活血榮絡方（11.7 g/kg）組和丁苯酞（60 mg/kg）組，每組10只，建立大腦中動脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型，連續ig藥物7 d。采用改良神經功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS）評價大鼠神經功能缺損癥狀；采用免疫熒光染色觀察海馬區CD34及皮質區VEGF表達；采用Western blotting法檢測各組大鼠梗死側腦組織中KLF4和VEGF蛋白表達情況；采用qRT-PCR法檢測各組大鼠腦組織中miR-34家族基因的表達；采用Pearson相關分析探討miR-34家族基因與mNSS、KLF4、VEGF的相關性。活血榮絡方能夠顯著改善大鼠神經功能缺損癥狀（＜0.01），增加海馬區CD34陽性細胞及皮質區VEGF表達（＜0.01），增強腦組織中KLF4和VEGF蛋白表達（＜0.01），抑制miR-34家族基因、、mRNA表達（＜0.01）；且mNSS與、、呈高度正相關（＜0.05）；VEGF與、、呈高度負相關（＜0.05）；KLF4與呈高度負相關（＜0.05），與呈高度負相關（＜0.01）?；钛獦s絡方能夠抑制、、mRNA表達，激活KLF4/VEGF傳導軸，促進腦梗死后血管新生，進而改善神經功能缺損癥狀。

活血榮絡方；腦梗死；血管新生；KLF4；VEGF；miR-34

腦梗死又稱缺血性腦卒中，是由于腦循環灌注障礙，缺血、缺氧所致局限腦組織缺血性壞死，出現相應神經功能缺損癥狀的臨床最常見腦血管病類型，約占全部急性腦血管病的70%[1]，是當前我國居民死亡的首要原因[2]。血管新生屬于三級腦側支循環范疇，在腦動脈閉塞后，血管內皮細胞（endothelial cells，ECs）增殖、遷移、分化，在原有微動/靜脈基礎上以芽生式形成新的血管，能夠代償性地為腦組織提供血流灌注[3]，促進病情恢復，是腦梗死藥物治療的關鍵切入點[4]。因此，積極尋求腦梗死后促血管新生的藥物具有重要的意義。

腦梗死屬中醫“缺血性腦卒中”范疇，在腦藏象理論指導下，本課題組首次提出缺血中風之“榮氣虛滯”病機理論體系[5]，認為榮氣是一切精微物質的總稱[6]，榮氣氣化的“精化氣-氣生變-變成形”過程與ECs增殖、遷移、分化相應，因此，在活血榮絡法指導下組方的活血榮絡方可能具有促腦梗死后血管新生的作用[7]?；跇s氣理論創制的活血榮絡方是湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，納入臨床路徑已13年，前期臨床與實驗研究發現活血榮絡方能夠上調微囊蛋白-1（caveolin-1，CAV-1）表達，下調基質金屬肽酶-9（matrix metallopeptidase-9，MMP-9）表達，激活Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路，減輕腦梗死急性期炎性反應，增加腦缺血區微血管密度（microvessel density，MVD），促進血管新生，改善腦梗死后神經功能缺損[8-13]，但活血榮絡方促腦梗死后血管新生的作用機制仍有待進一步研究。Kruppel樣因子4（Kruppel-like factor 4，KLF4）是鋅指轉錄因子家族蛋白之一，是雙向調控轉錄因子，能夠易位過表達，正向介導血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，）mRNA和蛋白的表達，可以形成KLF4/VEGF傳導軸促進血管新生，且Targetscan數據庫預測發現KLF4是miR-34家族基因的下游靶基因，因此本研究以miR-34家族基因與KLF4/VEGF傳導軸之間的相關性為切入點，探討活血榮絡方促腦梗死后血管新生的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠40只，10～12周齡，體質量250～280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。動物飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心，晝夜交替12 h，溫度21～26 ℃，濕度40%～50%。動物實驗經湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗倫理委員會批準（批準號20201010-8）。

1.2 藥材

活血榮絡方（湘藥制字Z20080472）由雞血藤30 g、石楠藤30 g、生地黃15 g、玄參10 g、黃精15 g、乳香10 g、沒藥10 g、川芎10 g組成，以上藥材均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院張裕民主任藥師鑒定分別為豆科植物密花豆Dunn的干燥藤莖、胡椒科植物石楠藤(Miq.) Hand. -Mazz.的干燥帶葉莖枝、玄參科植物地黃Libosch.的干燥塊根、玄參科植物玄參Hemsl.的干燥根、百合科植物黃精Red.的干燥根莖、橄欖科乳香樹屬植物乳香樹Birdw.樹皮滲出的樹脂、橄欖科植物地丁樹Engl.的干燥樹脂、傘形科植物川芎Hort.的干燥根莖，均符合《中國藥典》2015年版規定。

1.3 藥品與試劑

丁苯酞軟膠囊（批號H20050299，0.1 g/粒）購自中國石藥集團恩必普藥業有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復液（pH 8.0，批號G1206）、自發熒光淬滅劑（批號G1221-2）、488山羊抗兔熒光抗體（批號GB25303）、CY3山羊抗小鼠熒光抗體（批號GB21301）、CY3熒光TSA抗體（批號G1223）、DAPI染液（批號G1012）、RNA提取試劑盒（批號G3013）、RT First Strand cDNA Synthesis Kit（批號G3330）、2×SYBR Green qPCR Master Mix（批號G3322）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；VEGF熒光抗體（批號19003-1-ap）購自武漢三鷹生物技術有限公司；CD34熒光抗體（批號ab81289）、KLF4抗體（批號ab106629）、VEGF抗體（批號ab46154）、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號ab150120）購自英國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號70-PQ0012）購自杭州聯科生物技術股份有限公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（批號CW0022S）購自康為世紀生物科技有限公司；Immobilon Western HRP底物（批號WBKLS0100）購自美國Millipore公司；PageRulerTMPrestained Protein Ladder（批號26616）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；β-actin抗體（批號20536-1-AP）購自美國Proteintech公司；HyPureTMMolecular Biology Grade Water（批號SH30538.02）購自美國HyClone公司。

1.4 儀器

HM325型石蠟切片機、NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ECLIPSE C1型正置熒光顯微鏡、DS-U3型顯微成像系統（日本Nikon公司）；Mini-Protean Tetra小型垂直電泳槽、Mini Trans-Blot型轉印槽、PowerPac Basic基礎電泳儀、Gel Doc XR＋凝膠成像系統、qRT-PCR儀（美國Bio-Rad公司）；0.22 μm PVDF膜（美國Millipore公司）；D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機（北京大龍興創實驗儀器有限公司）；SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；FBZ2001-up-p標準試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司）；Enspire多功能酶標儀（美國Perkinelmer公司）。

2 方法

2.1 活血榮絡方的制備

將乳香、沒藥粉碎，其余藥材混合，加入10倍量水浸泡12 h后煎煮2 h；加入8倍量水煎煮1 h；加入5倍量水煎煮1 h；合并3次提取液，于旋轉蒸發儀上濃縮，冷卻后得到活血榮絡方浸膏，于4 ℃保存備用。采用高效液相色譜法對活血榮絡方進行質量控制，其主要有效成分芒柄花素、薯蕷皂苷、正丁烯基苯酚、黃芩苷的質量分數分別為4.298、3.568、1.779、18.634 mg/g。

2.2 大鼠腦缺血再灌注模型的制備

SD大鼠適應性飼養7 d，術前12 h禁食不禁水，ip 10%水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉，參考Longa等[15]報道的大腦中動脈阻塞法，梗阻大鼠右側大腦中動脈。鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，從頸外動脈和頸內動脈分叉部（4±2）mm處剪口進拴線，插入拴線（18±2）mm，將頸內動脈掛線系牢；缺血2 h后，拔出拴線進行再灌注，以制備大腦中動脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型。

2.3 分組與給藥

采用SPSS 23.0軟件設置隨機數的方法，將40只SD大鼠隨機分為對照組10只和造模組30只，造模組按“2.2”項下方法造模；對照組分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，不插入拴線，其余過程與模型制備方法相同。參考Zea-Longa’s標準評分法[15]，取造模后評分為1～3分的大鼠30只，隨機分為模型組、活血榮絡方（11.7 g/kg）[9-12]組和丁苯酞（60 mg/kg）[14]組，每組10只?；钛獦s絡方浸膏以蒸餾水稀釋成質量濃度為1.1 g/mL（以生藥量計）的藥液；丁苯酞軟膠囊用麻油配制成質量濃度為6 mg/mL的混懸液。術后6 h，各給藥組ig相應藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續7 d。實驗過程中出現死亡、取材時發現蛛網膜下腔出血或腦出血的大鼠予以剔除。

2.4 活血榮絡方對MCAO/R大鼠改良神經功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS）的影響

分別于給藥后第1、3、7天，采用mNSS[16]評價各組大鼠神經功能缺損癥狀，包括運動、感覺、平衡木、反射消失或動作異常等共18分，評分越高，損傷程度越嚴重。

2.5 活血榮絡方對MCAO/R大鼠腦組織海馬區CD34和皮質區VEGF表達的影響

各組隨機取5只大鼠，麻醉后斷頭取腦，依次將切片放入二甲苯15 min，無水乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，蒸餾水洗滌。石蠟切片脫蠟至水后，以EDTA抗原修復緩沖液（pH 8.0）進行抗原修復，于PBS脫色，加入牛血清白蛋白孵育30 min，分別加入VEGF抗體（1∶3000）和CD34抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜；PBS洗滌后加入二抗，室溫避光孵育50 min，洗滌后加入DAPI染液，室溫避光孵育10 min，洗滌后用抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J 1.8.0軟件，隨機取海馬區5個視野，分別對5個視野中CD34陽性細胞計數，取5個視野的均數，參考Weidner法[17]計算MVD值；采用Image J 1.8.0軟件分析VEGF陽性表達的平均熒光強度。

2.6 活血榮絡方對MCAO/R大鼠腦組織KLF4和VEGF蛋白表達的影響

各組剩余的5只大鼠，麻醉后斷頭取腦，取梗死側腦組織皮質區，加入裂解液勻漿，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉1.5 h，分別加入KLF4、VEGF抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，10 min/次，加入山羊抗兔抗體（1∶10 000），室溫孵育60 min，洗滌后顯色成像，采用Image J 1.8.0分析條帶灰度值。

2.7 活血榮絡方對MCAO/R大鼠腦組織miR-34a、miR-34b和miR-34c mRNA表達的影響

按照試劑盒說明書提取各組大鼠腦組織皮質區總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1，以為內參。

表1 引物序列

2.8 大鼠腦組織miR-34家族基因與mNSS、KLF4和VEGF的相關性

根據模型組、活血榮絡方組、丁苯酞組大鼠7 d的mNSS、腦組織中KLF4、VEGF相對蛋白表達量與腦組織中miR-34家族基因表達量，采用SPSS 23.0軟件進行相關性分析，并通過R語言3.6.3分別繪制、、與mNSS、KLF4、VEGF之間的相關性分析圖。當＜0.05時，則兩變量存在相關性；＞0時為正相關，＜0為負相關；0≤??＜0.3為低度相關，0.3≤??＜0.5為中度相關，0.5≤??＜1為高度相關；??越大，相關關系越大。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 活血榮絡方對MCAO/R大鼠mNSS的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠mNSS顯著升高（＜0.01），神經功能缺損嚴重；與模型組比較，活血榮絡方組3 d mNSS顯著降低（＜0.05），各給藥組7 d mNSS顯著降低（＜0.01），神經功能明顯改善。

3.2 活血榮絡方對MCAO/R大鼠腦組織海馬區CD34和皮質區VEGF表達的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠海馬區MVD數量和皮質區VEGF表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組海馬區MVD數量和皮質區VEGF陽性表達均顯著升高（＜0.01）。

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同

3.3 活血榮絡方對MCAO/R大鼠腦組織KLF4和VEGF蛋白表達的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組腦組織中KLF4和VEGF蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組KLF4和VEGF蛋白表達水平均進一步升高（＜0.01）。

3.4 活血榮絡方對MCAO/R大鼠腦組織miR-34a、miR-34b和miR-34c mRNA表達的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組腦組織、、mRNA表達水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組腦組織、、mRNA表達水平均顯著降低（＜0.01）。

3.5 大鼠腦組織中miR-34家族基因與mNSS、KLF4和VEGF的相關性

如圖5所示，mNSS與、、呈高度正相關，相關系數（）分別為0.60、0.56、0.56（＜0.05）；VEGF與、、呈高度負相關，分別為?0.58、?0.58、?0.69（＜0.05）；KLF4與呈高度負相關，為?0.64（＜0.05），與呈高度負相關，為?0.88（＜0.01）。

圖2 活血榮絡方對MCAO/R大鼠腦組織海馬區CD34和皮質區VEGF表達的影響 (×400)

Fig. 2 Effect of Huoxue Rongluo Recipe on expressions of CD34 in hippocampus and VEGF in cortex of MCAO/R rats (× 400)

4 討論

腦梗死疾病發生后，局部低氧致血管新生誘導因子在腦組織中高表達，推進由誘導因子與抑制因子組成的血管新生平衡向促進修復的方向移動，啟動內源性血管新生，形成大量微血管，為缺血缺氧腦組織提供灌注與營養。VEGF作為血管新生誘導因子，腦梗死后低氧環境能誘導其應激性表達增高，進而促進ECs增殖、遷移、分化成管，調控血管通透性，改善腦微循環，是腦梗死后血管新生的標志蛋白之一[18]。KLF4/VEGF軸可介導下游磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路[19]、磷脂酶C-γ1（phospholipase C γ-1，PLCγ-1）-蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路[20]、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路[21]，促進ECs增殖、遷移、分化成管，調控Rho家族蛋白促進血管偽足形成[22]，在多種疾病血管新生中發揮重要作用[23]。研究發現，KLF4在腦梗死疾病中過表達[24]，能夠通過轉錄激活肺腺癌轉移相關轉錄物1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）抑制腦梗死后血管內皮細胞凋亡[25]，也能夠通過改善血管內皮炎性反應并調節緊密蛋白表達[26]，從而減輕腦血管損傷，促進腦梗死后神經功能恢復。因此，腦梗死后血管新生的作用機制可能與低氧誘導激活KLF4/VEGF傳導軸并介導下游通路、改善腦血管損傷、促進神經功能恢復有關。

圖3 活血榮絡方對MCAO/R大鼠腦組織KLF4和VEGF蛋白表達的影響

圖4 活血榮絡方對MCAO/R大鼠腦組織miR-34a、miR-34b和miR-34cmRNA表達的影響

圖5 大鼠腦組織中miR-34家族基因與mNSS、KLF4和VEGF的相關性

miRNA是一類廣泛長度約為22個堿基的非編碼RNA，能夠特異性識別下游目的基因mRNA 3’UTR，并形成不完全互補配對，裂解下游目的基因mRNA，進而阻斷下游目的基因表達，參與調控ECs的增殖、遷移、分化成管的過程[27]。miR-34家族基因由、、組成，能夠靶向負調控血管新生，為抗血管新生藥物的開發提供了前景[28]。何灝龍等[29]通過微陣列技術發現miR-34家族基因在腦梗死大鼠模型中差異表達，歸屬于MAPK、JAK2/STAT3等信號通路，參與腦梗死疾病后的神經功能恢復過程。同時本課題組前期通過Targetscan數據庫[30]（http://www.targetscan.org/ vert_72/）發現，KLF4的轉錄后翻譯過程主要受miR-34家族基因調控，其中的預測分數為97分，權重分數為?0.48；的預測分數為97分，權重分數為?0.49；的預測分數為97分，權重分數為?0.49?；诖?，可初步認為腦梗死疾病發生后，miR-34家族基因可能靶向調控KLF4/VEGF傳導軸，參與腦梗死后血管新生進程。

《中國急性缺血性腦卒中診治指南（2018）》[31]指出，腦梗死早期不能溶栓者，早期建議使用丁苯酞、人尿激肽原酶等藥物，以改善腦循環（II級推薦，B級證據）。丁苯酞是國內開發的I類新藥，能夠有效改善腦梗死患者腦缺血區微循環及側支循環，促進腦梗死后血管新生，增加腦缺血區的腦血流灌注，改善神經功能缺損[32]。但是臨床上改善腦梗死患者側支循環藥物相對較少，臨床療效有待進一步提升，因此以腦梗死后3級側支循環血管新生為切入點，在中醫榮氣氣化理論指導下，研究活血榮絡方促腦梗死后血管新生的分子機制，應用于臨床轉化，具有重要的意義。

本研究表明，活血榮絡方與丁苯酞均能夠改善腦梗死大鼠神經功能缺損癥狀，且隨著給藥時間延長，效果越明顯。CD34、VEGF被認為是血管生成的間接標志物[33]，CD34是ECs首選標志物，是ECs損傷后修復的重要物質之一，VEGF與缺血區周圍新生血管數量密切相關，血管新生發生時CD34與VEGF正相關。楊洋等[34]采用CD34標記海馬區新生血管，證實腦梗死大鼠模型中細胞外信號調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）通路的激活能夠啟動內源性血管新生；Chan等[35]采用VEGF標記皮質區新生血管，證實硫酸乙酰肝素能夠促進腦梗死后血管新生，進而改善神經功能。免疫熒光結果顯示，腦梗死大鼠海馬區CD34陽性細胞數目與皮質區VEGF平均熒光強度較對照組明顯升高，且藥物干預作用下，二者表達水平進一步升高，提示腦梗死疾病發生后，機體可啟動內源性血管新生，且活血榮絡方與丁苯酞能夠進一步促進腦梗死后血管新生。Western blotting結果顯示，腦梗死大鼠腦組織中KLF4和VEGF蛋白表達較對照組升高，且藥物干預作用下，二者表達水平進一步升高，提示腦梗死后血管新生的作用機制與激活KLF4/VEGF傳導軸有關。qRT-PCR結果顯示，腦梗死大鼠腦組織中、、mRNA表達水平均顯著升高，且藥物能降低其表達水平，結合Pearson相關性分析結果，提示活血榮絡方與丁苯酞改善腦梗死大鼠神經功能缺損癥狀與miR-34家族基因調控KLF4/VEGF傳導軸相關。Jauhari等[36]研究發現miR-34家族基因在分化和衰老的腦細胞中高表達；Pandey等[37]研究發現miR-200與miR-34家族基因能夠靶向KLF4，在神經元的增殖分化中發揮關鍵作用；Li等[38]研究發現缺血缺氧環境下，抑制表達，能夠激活KLF4/VEGF軸，促進人臍靜脈內皮細胞HUVEC增殖、遷移、分化成管；Peng等[39]研究發現異氟醚能夠激活轉化生長因子-β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）/SMAD3通路，增加VEGF與CD34表達，促進腦梗死后血管新生，改善腦梗死大鼠神經功能缺損癥狀，在一定程度上與本研究結果相互佐證。

綜上所述，活血榮絡方能夠促進腦梗死后血管新生，改善神經功能缺損癥狀，可能與抑制、、mRNA表達，進而激活KLF4/VEGF傳導軸有關，本研究為中藥改善腦循環、防治腦梗死疾病提供了依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 肖波. 神經病學[M]. 第4版. 北京: 人民衛生出版社, 2019: 179-189.

[2] GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 359 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE) for 195 countries and territories, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017 [J]., 2018, 392(10159): 1859-1922.

[3] 楊仁義, 周德生, 傅馨瑩, 等. 基于STAT3/miRNA反饋環路探討中醫藥促腦梗死后血管新生的調控機制 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2020, 26(20): 221-228.

[4] 高長玉, 吳成翰, 趙建國, 等. 中國腦梗死中西醫結合診治指南(2017) [J]. 中國中西醫結合雜志, 2018, 38(2): 136-144.

[5] 周韓, 周德生, 劉利娟, 等. 缺血中風榮氣虛滯病機源流 [J]. 中醫學報, 2019, 34(9): 1844-1849.

[6] 周德生, 張雪花, 譚靜. 榮氣虛滯論 [J]. 中醫藥通報, 2005, 4(2): 22-25.

[7] 楊仁義, 周德生, 傅馨瑩, 等. 基于“榮氣理論-促血管新生”探討腦梗死的防治策略 [J]. 湖南中醫藥大學學報, 2020, 40(12): 1562-1566.

[8] 李中, 周德生, 江元璋, 等. 活血榮絡顆粒聯合針刺八脈交會穴治療腦梗死痙攣性癱瘓臨床研究 [J]. 中國中醫藥信息雜志, 2017, 24(5): 22-26.

[9] Zhou D, Li M, Hu H,. Huoxue Rongluo Tablet reduces matrix metalloproteinase-9 expression in infarcted brain tissue [J]., 2013, 8(34): 3216-3224.

[10] 周穎璨, 王洪海, 周德生, 等. 活血榮絡方對大鼠腦缺血再灌注損傷JAK2、STAT3表達的影響 [J]. 時珍國醫國藥, 2017, 28(9): 2111-2114.

[11] 周德生, 劉利娟, 寇志剛, 等. 活血榮絡片對大腦中動脈缺血模型大鼠腦組織微囊蛋白-1表達的影響 [J]. 河北中醫, 2016, 38(1): 80-84.

[12] 周德生, 劉利娟, 寇志剛, 等. 活血榮絡片對大鼠MCAO模型腦組織MVD表達的影響 [J]. 河南中醫, 2015, 35(5): 956-959.

[13] 楊仁義, 劉利娟, 康蕾, 等. 基于網絡藥理學的活血榮絡方對腦梗死血管新生作用機制研究 [J]. 中國中醫藥信息雜志, 2020, 27(8): 98-105.

[14] 康蕾. 基于GEO數據庫篩選腦梗死大鼠血清生物標志物及活血榮絡方干預作用研究 [D]. 長沙: 湖南中醫藥大學, 2020.

[15] Longa E Z, Weinstein P R, Carlson S,. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]., 1989, 20(1): 84-91.

[16] Hu G J, Feng Y G, Lu W P,. Effect of combined VEGF165/SDF-1 gene therapy on vascular remodeling and blood perfusion in cerebral ischemia [J]., 2017, 127(3): 670-678.

[17] Weidner N. Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors [J]., 1995, 36(2): 169-180.

[18] Jiang Y L, Liu W W, Wang Y,. MiR-210 suppresses neuronal apoptosis in rats with cerebral infarction through regulating VEGF-notch signaling pathway [J]., 2021, 25(1): 2.

[19] Cheng S Y, Zhang X X, Feng Q,. Astragaloside IV exerts angiogenesis and cardioprotection after myocardial infarction via regulating PTEN/PI3K/Akt signaling pathway [J]., 2019, 227: 82-93.

[20] Matsushima S, Shimizu A, Kondo M,. Anosmin-1 activates vascular endothelial growth factor receptor and its related signaling pathway for olfactory bulb angiogenesis [J]., 2020, 10(1): 188.

[21] Icli B, Li H, Pérez-Cremades D,. MiR-4674 regulates angiogenesis in tissue injury by targeting p38K signaling in endothelial cells [J]., 2020, 318(3): C524-C535.

[22] Hoang M V, Whelan M C, Senger D R. Rho activity critically and selectively regulates endothelial cell organization during angiogenesis [J]., 2004, 101(7): 1874-1879.

[23] Mai J, Zhong Z Y, Guo G F,. Polo-Like Kinase 1 phosphorylates and stabilizes KLF4 to promote tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma [J]., 2019, 9(12): 3541-3554.

[24] Sakuma R, Takahashi A, Nakano-Doi A,. Comparative characterization of ischemia-induced brain multipotent stem cells with mesenchymal stem cells: Similarities and differences [J]., 2018, 27(19): 1322-1338.

[25] Yang H J, Xi X X, Zhao B,. KLF4 protects brain microvascular endothelial cells from ischemic stroke induced apoptosis by transcriptionally activating MALAT1 [J]., 2018, 495(3): 2376-2382.

[26] Zhang X Y, Wang L, Han Z X,. KLF4 alleviates cerebral vascular injury by ameliorating vascular endothelial inflammation and regulating tight junction protein expression following ischemic stroke [J]., 2020, 17(1): 107.

[27] Wade S M, Ohnesorge N, McLoughlin H,. Dysregulated miR-125a promotes angiogenesis through enhanced glycolysis [J]., 2019, 47: 402-413.

[28] Maroof H, Salajegheh A, Smith R A,. Role of microRNA-34 family in cancer with particular reference to cancer angiogenesis [J]., 2014, 97(2): 298-304.

[29] 何灝龍, 鄭慧娥, 高音來, 等. 針刺調控腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側海馬差異miRNA信號歸屬通路及mir-34c-3p表達的研究 [J]. 中國康復醫學雜志, 2020, 35(11): 1290-1295.

[30] Agarwal V, Bell G W, Nam J W,. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs [J]., 2015, 4: e05005.

[31] 中華醫學會神經病學分會, 中華醫學會神經病學分會腦血管病學組. 中國急性缺血性腦卒中診治指南(2018) [J]. 中華神經科雜志, 2018, 51(9): 666-682.

[32] Wei H, Zhan L P, Zhang B,. Dl-3n-butylphthalide reduces oxygen-glucose deprivation-induced endothelial cell damage by increasing PGC-1α [J]., 2019, 23(10): 4481-4490.

[33] Carmeliet P, Jain R K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis [J]., 2011, 473(7347): 298-307.

[34] 楊洋, 劉曉楠, 馬超, 等. ERK1/2信號傳導通路在大鼠局灶性急性腦缺血再灌注中的作用 [J]. 中國動脈硬化雜志, 2013, 21(11): 987-992.

[35] Chan S J, Esposito E, Hayakawa K,. Vascular endothelial growth factor 165-binding heparan sulfate promotes functional recovery from cerebral ischemia [J]., 2020, 51(9): 2844-2853.

[36] Jauhari A, Singh T, Singh P,. Regulation of miR-34 family in neuronal development [J]., 2018, 55(2): 936-945.

[37] Pandey A, Singh P, Jauhari A,. Critical role of the miR-200 family in regulating differentiation and proliferation of neurons [J]., 2015, 133(5): 640-652.

[38] Li Y Z, Wen L, Wei X,. Inhibition of miR-7 promotes angiogenesis in human umbilical vein endothelial cells by upregulating VEGF via KLF4 [J]., 2016, 36(3): 1569-1575.

[39] Peng L, Yin J W, Wang S,. TGF-β2/Smad3 signaling pathway activation through enhancing VEGF and CD34 ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury after isoflurane post-conditioning in rats [J]., 2019, 44(11): 2606-2618.

Mechanism of Huoxue Rongluo Recipe on promoting angiogenesis after cerebral infarction based on miR-34 regulating KLF4/VEGF conduction axis

YANG Ren-yi1, YAN Si-yang1, ZHOU De-sheng2, FU xin-ying1, MA Qiang1, ZHANG Yu-xing1, GAO Xiao-feng2, LIU Li-juan2

1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China

Based on the correlation between miR-34 family genes and Kruppel-like factor 4 (KLF4)/vascular endothelial growth factor (VEGF) conduction axis to investigate the mechanism of Huoxue Rongluo Recipe (活血榮絡方) on promoting angiogenesis after cerebral infarction.SD rats were randomly divided into control group, model group, Huoxue Rongluo Recipe (11.7 g/kg) group and butylphthalide (60 mg/kg) group, 10 rats in each group. Middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) rats model were established, and rats were ig drugs for 7 d. Modified neurological severity score (mNSS) was used to evaluate the symptoms of neurological deficit in rats; Immunofluorescence staining was used to observe the expression of CD34 in hippocampus and VEGF in cortex; Western blotting was used to detect the expression of KLF4 and VEGF in infarcted brain tissue; qRT-PCR was used to detect the expression of miR-34 family genes in brain tissue; Pearson correlation analysis was used to observe the correlation between miR-34 family genes and mNSS, KLF4 and VEGF.Huoxue Rongluo Recipe significantly improved the symptoms of neurological deficits in rats (< 0.01), increased expression of CD34 positive cells in hippocampus and expression of VEGF in cortex (< 0.01), enhanced expression of KLF4 and VEGF protein in brain tissue (< 0.01), inhibited mRNA expressions of,and(< 0.01); mNSS was highly positively correlated with,and(< 0.05); VEGF was highly negatively correlated with,and(< 0.05); KLF4 was highly negatively correlated with(< 0.05), highly negatively correlated with(< 0.01).Huoxue Rongluo Recipe can inhibit expressions of,and, activate KLF4/VEGF conduction axis, promote angiogenesis after cerebral infarction, and then improve the symptoms of neurological deficits.

Huoxue Rongluo Recipe; cerebral infarction; angiogenesis; KLF4; VEGF; miR-34

R285.5

A

0253 - 2670(2021)16 - 4873 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.012

2021-02-04

國家自然科學基金資助項目（81874463）；湖南省科技廳科技創新平臺與人才計劃項目（2017SK4005）；湖南省重點研發計劃項目（2020SK2092）；湖南省財政中醫藥項目名院工程（rsk-010-013/006-09）；湖南省教育廳一般項目（20C1405）；湖南省衛健委科研項目（202103071190）；湖南省中醫藥管理局資助項目（202038，202046，2021218）；湖南省研究生創新項目（CX20190587）；湖南中醫藥大學中西醫結合一流學科開放基金項目（2019ZXYJH08，2018ZXYJH10）；湖南中醫藥大學研究生培養質量工程專項（2020CX62）

楊仁義（1996—），男，碩士研究生，從事神經系統疾病的中醫藥防治研究。Tel: 15700726938 E-mail: 792799735@qq.com

劉利娟（1985—），女，博士，主治醫師，從事中醫藥對腦血管病及其并發癥的防治研究。Tel: (0731)85369768 E-mail: 601264967@qq.com

[責任編輯 李亞楠]