黃芩苷脂質體凝膠制備、質量評價及其對痤瘡的藥效學評價

王佳輝，陳 麟，孫 平，陳子豪，李海艷，蘇 青

黃芩苷脂質體凝膠制備、質量評價及其對痤瘡的藥效學評價

王佳輝，陳 麟，孫 平，陳子豪，李海艷，蘇 青*

成都醫學院藥學院，四川 成都 610500

制備黃芩苷脂質體凝膠（baicalin liposomes gels，Bai-Lip-Gels），進行體外質量評價，并考察其治療輕、中度痤瘡的療效。首先采用單因素試驗，以包封率、粒徑為評價指標來考察處方工藝對脂質體制備的影響。其次，利用各因素與包封率之間的相關性選出影響脂質體制備的顯著因素，并運用Box-Behnken設計-響應面法進一步優化處方工藝。然后制備Bai-Lip-Gels，采用流變學進行表征，對其穩定性進行初步考察，并通過透析袋釋藥試驗和離體皮膚透皮試驗考察Bai-Lip-Gels的釋藥性能。最后，對Bai-Lip-Gels進行兔耳痤瘡的藥效學評價。成功制備黃芩苷脂質體（baicalin liposomes，Bai-Lip），其包封率為63.9%；在透射電子顯微鏡（TEM）下觀察可見脂質體呈規則球形，結構完整，分散均勻；其粒徑為（212.300±0.424）nm，多分散性指數（polydispersity index，PDI）為0.217±0.012，Zeta電位為（?32.4±0.9）mV，制備的Bai-Lip穩定。制備的Bai-Lip-Gels流變學性質穩定，在4 ℃冷藏貯存穩定性良好。離體皮膚透皮試驗結果表明，Bai-Lip-Gels在18 h內單位面積累積滲透量（18）為（81.38±2.81）μg/cm2，高于黃芩苷混懸劑凝膠（baicalin suspension gels，Bai-Sus-Gels）［18為（43.03±2.14）μg/cm2］，并對Bai-Lip-Gels和Bai-Sus-Gels的釋放曲線進行了方程擬合，Bai-Lip-Gels體外經皮滲透符合一級方程，Bai-Sus-Gels經皮滲透符合零級方程。初步藥效學試驗表明，在給藥治療后，組織病理染色結果可知，Bai-Lip-Gels組的療效顯著，主要體現在減輕角質化程度、局部組織充血、炎性程度等方面。從兔耳痤瘡模型血清中腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β、白細胞介素6、白細胞介素8分泌的影響發現，Bai-Lip-Gels能顯著降低兔耳痤瘡的炎癥因子水平，且療效優于陽性對照組阿達帕林凝膠。制備的Bai-Lip-Gels用于兔耳痤瘡治療，能有效減輕角質化程度，減輕局部組織充血，降低炎癥因子水平，為治療輕、中度炎癥性痤瘡提供制劑開發的依據。

黃芩苷；脂質體凝膠；Box-Behnken設計-響應面法；經皮滲透；痤瘡；炎癥；藥效學

黃芩苷（baicalin，Bai）是唇形科黃芩屬植物黃芩Georgi干燥根莖中提取的黃酮類活性成分[1]，不僅有很強的抗炎活性[2]，還具有抑制革蘭氏陽性菌痤瘡丙酸桿菌的作用[3]，將其開發成外用抗痤瘡制劑局部起效、避免全身影響、無肝臟首過效應[4]，具有很大的市場潛力。但是黃芩苷存在難溶于水，皮膚透過率低等問題，限制了其在皮膚外用制劑上的應用[5]。陳遙等[6]采用促透劑促進黃芩苷凝膠中黃芩苷對皮膚的經皮透過量，在一定程度上能夠增加累積透過量，但難以解決藥物透過量達到一定限度時，大量的黃芩苷滯留在皮膚表面而不能持續透過皮膚表層發揮藥效的問題。熊欣等[7]制備黃芩苷脂質體凝膠（baicalin liposomal gels，Bai-Lip-Gels）并對體外透皮性能進行評析，發現黃芩苷混懸劑凝膠（baicalin suspension gels，Bai-Sus-Gels）與普通脂質體凝膠具有相似的體外透皮性能，在透皮性能上無顯著性優勢。儲曉琴等[8]對Bai-Lip-Gels體外釋藥與穩定性進行了研究，發現Bai-Lip-Gels具有一定的緩釋性，并在低溫下貯存穩定性更佳。

近年來，脂質體（liposomes，Lip）作為藥用中間載體成為了一大熱點，其類脂雙分子層結構具有良好的生物相容性以及藥物包載能力[9]，但是脂質體溶液的流動性，不宜長時間滯留在皮膚表面。而將脂質體均勻混合在凝膠基質中制備的脂質體凝膠劑，能解決流動性問題[10]，同時也具備提高藥物滯留時間、穩定性、緩釋性以及減少藥物本身的刺激性等優點[11]。因此，本研究將黃芩苷制備成脂質體凝膠，對其進行質量評價，考察流變學性質、初步穩定性以及體外經皮滲透，在此基礎上，以兔耳痤瘡模型來評價Bai-Lip-Gels的初步藥效學，為將黃芩苷開發成治療輕、中度痤瘡的外用制劑提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

千分之一電子天平、十萬分之一電子天平，德國Mettler Toledo公司；pHS-4C+智能型酸度計，成都世紀方舟科技有限公司；MCR302流變儀，安東帕；DV3T粘度計，德國Brookfield公司；Agilent1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；NanoZS90激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；JY90-IIN超聲波細胞粉碎機、ST16R高速冷凍離心機，寧波新芝生物科技股份有限公司；RV10旋轉蒸發儀、RW20頂置式攪拌器，德國IKA集團；優普純水機，四川優普超純科技有限公司；JEM-1200EX透射電子顯微鏡（TEM），日本JEOL公司；Epoch酶標檢測儀，美國BioTek Instruments公司。

1.2 動物

健康SPF級SD雄性大鼠，200～250 g，成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（川）2019-031。

清潔級雄性新西蘭兔，質量2.0～2.5 kg，購于成都達碩動物養殖中心。飼養于成都醫學院實驗動物中心動物室，使用許可證：SYXK（川）2020-196，清潔級，溫度18～20 ℃，相對濕度40%。

本實驗過程中所有動物實驗均符合成都醫學院實驗動物倫理審查委員會相應的審查要求。

1.3 試劑

黃芩苷對照品，成都曼思特生物科技有限公司，批號15112909，質量分數99%；黃芩苷原料藥（批號G07S11L123706，質量分數90%）、大豆卵磷脂（批號T12O10F99737）、維生素E（批號D20D9S77848），上海源葉生物科技有限公司；膽固醇，批號2020010101，成都市科隆化學品有限公司；聚山梨酯80，天津市科密歐化學試劑有限公司；卡波姆974P，批號22318012，美國Lubrizo公司；氯仿，天津市大茂化學試劑廠；甲醇，色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；氫氧化鈉，批號190501，四川金山制藥有限公司；中性樹膠，批號10004160，國藥集團化學試劑有限公司；痤瘡丙酸桿菌，批號336443，河南省微生物菌種保藏中心；油酸，嘉興科隆化工有限公司；兔腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、兔白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8酶聯免疫分析（批號ml0016961、ml027836、ml051629、ml027347），上海酶聯生物科技有限公司；所用純化水為實驗自制超純水。

2 方法與結果

2.1 黃芩苷含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Welchrom-C18柱（250 mm×4.6 mm，5mm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（47∶53，磷酸調pH值至2.20±0.05）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫35 ℃；進樣量20mL。

2.1.2 供試品溶液的配制 取Bai-Lip-Gels 1.0 g，置于10 mL量瓶中，加流動相溶解定容至刻度線，同法制備3份，微孔濾膜濾后，吸取濾液1 mL至10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液，待測定。

2.1.3 專屬性考察 稱取黃芩苷對照品10.00 mg，置于100 mL量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度，制成100 μg/mL對照品儲備液。精密量取儲備液5 mL，置于10 mL量瓶中，使用流動相稀釋并定容至刻度，制成50 μg/mL的對照品溶液；稱取空白脂質體凝膠1.00 g，置于10 mL量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度；稱取Bai-Lip-Gels 1.00 g，置于10 mL量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度；分別取上述溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰，考察系統適應性。結果見圖1，結果表明，空白的脂質體凝膠基質不會干擾黃芩苷的測定，方法專屬性較高。

2.1.4 線性關系考察 稱取黃芩苷對照品10.00 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋并定容至刻度，得到1 mg/mL的對照品母液。吸取母液各50、100、200、300、400、600、800mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，制得質量濃度分別為5、10、20、30、40、60、80 μg/mL的系列對照品溶液。采用高效液相色譜儀進行測定。以黃芩苷質量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（）進行線性回歸，得到標準曲線為＝62.171－29.414，2＝0.999 8，表明黃芩苷在5～80mg/mL線性關系良好。

A-黃芩苷對照品 B-Bai-Lip-Gels C-空白凝膠基質

2.1.5 精密度試驗 取黃芩苷對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，連續進樣測定6次，記錄峰面積，計算得黃芩苷峰面積RSD為1.38%，表明實驗儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 按“2.1.2”項下方法配制10、30mg/mL黃芩苷的供試品溶液，分別在室溫下于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，10、30mg/mL黃芩苷的供試品溶液在24 h內峰面積的RSD分別為0.33%、0.38%，表明在24 h內供試品溶液穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取Bai-Lip-Gels 6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算黃芩苷質量分數的RSD為2.78%，表明本實驗重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 按“2.1.2”項下方法配制低、中、高質量濃度（10、30、60mg/mL）黃芩苷的供試品溶液各3份，分別加入處方比例量的輔料，進液相測定。結果顯示，高、中、低質量濃度回收率均在95%～105%，平均回收率為100.03%，RSD為0.25%。

2.2 黃芩苷脂質體（baicalin liposomes，Bai-Lip）的制備工藝優化

2.2.1 Bai-Lip的制備 在前期脂質體制備方法篩選的基礎上，采用薄膜分散法[12]制備Bai-Lip。稱取處方量的大豆卵磷脂、膽固醇、維生素E和聚山梨酯80在氯仿和甲醇混合液中溶解混合均勻，置于旋轉蒸發器上，在28 ℃、55 r/min轉速下制得類脂薄膜，加入由磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解的處方量黃芩苷，在45 ℃、低壓、旋蒸震蕩制得Bai-Lip，將制得的Bai-Lip放置常溫后冰箱冷藏一定時間，隨即將冷藏后的樣品通過探針式超聲，濾膜濾過，整粒得到Bai-Lip。

2.2.2 Bai-Lip包封率測定 取Bai-Lip 1 mL于4 ℃條件下高速冷凍離心15 min（14 000 r/min），精密吸取上清液適量，定容到1 mL，在上述“2.1”項HPLC條件測定其中黃芩苷的含量作為游。另取1 mL脂質體，以10倍量的甲醇進行破乳，測定其中黃芩苷的含量作為總，計算包封率。

包封率＝(總－游)/總

2.2.3 處方工藝的單因素考察 制備Bai-Lip，固定處方中其他比例不變（基于平衡溶解度實驗確定黃芩苷用量15 mg、水化轉速55 r/min），分別對有機溶劑（氯仿、甲醇及氯仿-甲醇2∶1、1∶1、1∶2）、類脂比（膽固醇-磷脂4∶9、3∶10、2∶11、1∶12）、水化溫度（30、35、40、45 ℃）、探超振幅（20、40、60、80、100 W）、水化體積（1、2、3、4、5 mL）、水化時間（25、35、45、55、65 min）進行單因素考察，結果見表1～6。采用NanoZS90激光粒度儀和HPLC法測定Bai-Lip的粒徑及包封率，以考察各因素對脂質體納米粒的粒徑及包封率的影響。

表1 溶劑種類對Bai-Lip的粒徑及包封率的影響(, n = 3)

表2 類脂比對Bai-Lip的粒徑及包封率的影響(, n = 3)

表3 水化溫度對Bai-Lip的粒徑及包封率的影響(, n = 3)

表4 探超振幅對Bai-Lip的粒徑及包封率的影響(, n = 3)

表5 水化體積對Bai-Lip的粒徑及包封率的影響(, n = 3)

2.2.4 各因素與包封率的相關性分析 對各因素與包封率之間進行相關性分析，結果見表7。類脂比和水化體積與包封率之間的相關性顯著（＜0.01），其他因素對Bai-Lip包封率影響不明顯，其影響依次為類脂比＞水化體積＞水化時間＞水化溫度＞溶劑比例＞探超功率。后續的處方工藝的優化將從類脂比、水化體積等因素入手。

表6 水化時間對Bai-Lip的粒徑及包封率的影響(, n = 3)

2.2.5 響應面法優化處方 根據各因素與包封率之間進行相關性分析，選取影響較大的因素水化體積（1）、類脂比（2）、水化時間（3），進行工藝優化，采用3因素3水平進行實驗設計，Box-behnken試驗設計及結果見表8，共進行17次實驗。采用Design-Expert 12軟件進行處理。并對得到的結果進行相應的驗證和對比，以此來判斷制備工藝的優勢和可靠性。

表7 各因素與包封率的相關性分析結果

**相關系數在0.01水平上顯著（雙側）

**the correlation coefficient is significant at the 0.01 level (two-sided)

表8 Bai-Lip處方工藝Box-behnken試驗設計及結果

模型擬合及方差分析以包封率（）為響應值，應用Design Expert 12軟件分別對1（類脂比）、2（水化體積）、3（水化時間）進行多元線性回歸和二項式擬合，得到回歸方程＝64.90＋1.911＋1.912＋2.533－1.1312－0.2013－0.1523－7.5112－6.6122－5.0932，2＝0. 984 4。

由表9可知，表明實驗模型有很高的顯著性 （值＝48.99，＜0.000 1），該方程與實際情況擬合較好。失擬項值＝1.38，＝0.369 1，說明失擬項不顯著，未知因素對試驗結果干擾小。3種因素都有比較明顯的影響（＜0.01），影響Bai-Lip制 備的顯著性排列順序為水化時間＞水化體積＝類脂比。模型的相關系數2＝0.984 4，因此，可以用此模型方程對制備的脂質體的實驗結果進行合理分析。

采用響應面對其優化和預測，應用Design- Expert 12軟件，基于二項式擬合模型，固定3個變量中的1個變量，繪制另外2個變量對包封率影響的三維響應面，結果見圖2。

表9 Bai-Lip包封率回歸模型方差分析

圖2 各因素相互關系及包封率的三維響應面和等高線圖

經軟件分析篩選，得到Bai-Lip的最優制備工藝參數為水化時間47 min，類脂比3∶10，水化體積3 mL，預測包封率分別為65.7%。

2.3 脂質體的形態粒徑及包封率

2.3.1 形態觀察 取適量脂質體，移取PBS液進行10倍體積稀釋。稀釋后再移取20 μL溶液，置于銅網上吸收后，加1%磷鎢酸適量染色1 min，自然風干后，TEM下觀察其形狀并進行拍照，結果見圖3。可見脂質體呈規則球形，結構完整，分散均勻。

2.3.2 平均粒徑及Zeta電位 取適量Bai-Lip，用PBS緩沖液10倍體積稀釋，采用馬爾文激光粒度儀對脂質體的粒徑分布及Zeta電位進行測定。其平均粒徑為（212.300±0.424）nm，分布均勻，多分散指數（polymer dispersity index，PDI）為0.217±0.012，Zeta電位為（?32.4±0.9）mV。

圖3 Bai-Lip的外觀及TEM圖

2.3.3 驗證試驗 通過相應的優選處方進行溶液的配制，選擇3批樣品，并將包封率作為一個驗證標準。結果見表10。其中優選配方的平均包封率為63.9%，與預測包封率（65.7%）較為接近。進一步表明處方的可行性。

表10 脂質體制劑處方驗證試驗結果

2.4 Bai-Lip-Gels的制備

脂質體為液體劑型，在皮膚上的保留時間較短，為了使藥物長時間與皮膚接觸，需采用凝膠基質對其進行賦形。稱取卡波姆974P 0.5 g置于燒杯中并加入15.0 g純化水使其在攪拌器中先低轉速再高轉速攪拌溶脹，待溶脹充分，形成透明、細膩、無顆粒感的凝膠后加入適量的5% NaOH溶液調節pH值，使pH值在6.5～7.5，即得空白凝膠基質。

取新制備的脂質體溶液、黃芩苷混懸液各30 mL加入至空白凝膠中抽真空緩慢攪拌形成Bai-Lip-Gels和黃芩苷混懸凝膠，形成的凝膠中黃芩苷的含藥量為3 mg/g。

2.4.1 黏度測試 采用DV3T旋轉粘度計[13]，計算2～5 min的單點平均值即為Bai-Lip-Gels的黏度。由表11可知，黏度計在25 ℃、轉速20 r/min條件下測得3批的黏度差異不大，扭矩在40%～60%，測得的黏度值可信，黏度在33～35 Pa?s，表明制備的凝膠具有良好的重現性。

2.4.2 流變學表征 流變學作為常見研究黏彈性流體力學性質的重要試驗[14]，是作為表征流變性質的特征量[15]。本實驗運用流變學方法，通過測量凝膠的流變參數，考察該凝膠在不同剪切應力或者剪切應變條件下測試黏度掃描、屈服應力掃描以及振幅掃描，評價所形成凝膠的力學性能，為Bai-Lip-Gels體外評價及全面質量控制提供參考和借鑒。

表11 Bai-Lip-Gels黏度測試

安東帕流變儀程序中選擇測量的項目模板，儀器預熱30 min后，先將Bai-Lip-Gels置于下板中央，再用平面刮刀將多余的樣品刮掉，待準備就緒后，運行儀器。

黏度曲線確定凝膠的流變類型以及樣品的觸變回復能力。程序參數為剪切速率0.01～100 s?1/100～0.01 s?1對數變化；取樣時間：20～1 s/1～20 s，對數變化，41個取樣點；溫度設定為25 ℃。Bai-Lip- Gels黏度曲線見圖4。由圖4可知，隨著剪切速率的增大，Bai-Lip-Gels的黏度逐漸變稀，表明該凝膠屬于剪切變稀流體，即假塑性流體。

針對非牛頓流體，在施加的剪應力較小時流體只發生變形，不產生流動[16]，當剪切應力增大到某一定值時該凝膠才開始流動，此時的剪切應力達到最大值也稱為該凝膠的屈服應力。程序參數：剪切速率恒定值0.2 s?1，測試點取點時間1 s，數據點60個點，結果見圖5。

振幅掃描對凝膠施加剪切應力或者剪切應變在一定范圍內時，凝膠的結構產生彈性形變，并且產生的形變能夠回復，結構沒有被破壞，此時相應的應力或應變為凝膠的線性黏彈區。當施加的應力或應變產生的形變不能回復時，此區域為凝膠的非線性黏彈區。通過對Bai-Lip-Gels進行振幅掃描來確定樣品的線性粘彈區，在此區域樣品為凝膠狀態，當儲能模量（′）與損耗模量（′′）相等時，此時為樣品的流動點，見圖6。程序參數：剪切應變0.02%～100%，角頻率5 rad/s，取點時間30～1 s/1～30 s，共41個取樣點，溫度25 ℃。

圖4 黏度掃描測試

圖5 屈服應力測試

制備3批Bai-Lip-Gels，進行流變學測試：黏度曲線掃描、屈服應力掃描以及振幅掃描測試，得到該凝膠的相關流變學特性，結果見表12。由表12可知，黏度曲線掃描可知，剪切速率為0.1、1、10 s?1時，3批樣品對應的黏度變化范圍不大。振幅掃描可知，當儲能模量′大于400 Pa時，樣品處于線性黏彈區，此時樣品呈凝膠狀態。由屈服應力掃描結果可知，剪切應力在70～90 Pa為該凝膠的屈服應力值，3批脂質體的流變數據較為穩定，無明顯差異，表明該凝膠劑的流變性質穩定。

圖6 振幅掃描測試

表12 Bai-Lip-Gels流變學測試

-剪切速率-剪切應力rel-觸變面積

-share rate-shear stressrel-thixotropic area

2.4.3 Bai-Lip-Gels的初步穩定性考察 本品進行肉眼外觀的考察，為淡黃色、細膩、均勻性良好、粘度適中的半固體凝膠，見圖7，取1.0 g加純化水稀釋至10 g，分散均勻后，用pH計測得其pH值為6.42±0.13。

圖7 Bai-Lip-Gels外觀圖

取Bai-Lip-Gels 3批，分別裝入西林瓶中，于4 ℃冷藏條件下放置30 d，分別在第7、14、21、30天取樣[17]，與第0天樣品比較，Bai-Lip-Gels的外觀性狀、黏度及含量的變化，含量測定按“2.1”項下的HPLC方法進行檢測，結果見表13。由表13可知，存放于4 ℃冷藏條件下30 d，其外觀性狀、黏度和含量均無明顯變化，表明Bai-Lip-Gels在此條件下狀態穩定。

2.4.4 透析袋釋放實驗 分析比較Bai-Lip-Gels與黃芩苷混懸劑凝膠體（Bai-Sus-Gels）外釋放度[18]。500 mL PBS等滲緩沖液作為釋放介質，溫度32 ℃，攪拌速度控制在300 r/min，確保釋放介質的流動性良好。在1、2、4、6、8、10、12、18、24、36 h，按時取樣，每次取樣3 mL，并補充3 mL等溫釋放介質，采用“2.1”項下的HPLC法測量黃芩苷含量。

表13 Bai-Lip-Gels4 ℃冷藏試驗

實驗表明，Bai-Sus-Gels有著較快的釋放速度，在12 h前釋放較快，且在12 h時，其釋放率已經超過了90%，在18 h之后，釋放趨于穩定。Bai-Lip-Gels中藥物釋放在前2 h釋放較快，由未包封的黃芩苷釋放所引起，2 h后釋放速率開始變緩慢，表現出緩釋的效果，36 h內釋放68.53%，見圖8。

2.4.5 離體皮膚透皮實驗 將SD大鼠采用隨機數字表將其分為2組，腹部備皮，剝離腹皮，刮去角質層以及淺表層脂肪，用生理鹽水洗凈后剪成若干份相同大小的腹部組織，置于無菌生理鹽水中，放入?20 ℃冰箱保存備用。

圖8 Bai-Lip-Gels與Bai-Sus-Gels 36 h累積釋放率曲線(, n = 5)

將處理好的大鼠腹皮從?20 ℃冰箱中取出，用生理鹽水浸泡半小時。等滲PBS（pH 7.4）作為透皮吸收試驗的接收液。皮膚角質層面向供給池，且鼠皮面積略大于擴散池表面積，置于Franz擴散池的供給池與接收池結合處，用夾子固定[19]。先用接受液平衡30 min后給藥[20]。將Bai-LiP-Gels與Bai- Sus-Gels分別涂于2組大鼠腹部皮膚表面，接觸面積為3.14 cm2，水浴恒溫至（32.0±0.5）℃，300 r/min恒速攪拌。于1、2、4、6、8、10、12、18 h從接收池中取3 mL并補加相同量的釋放介質。樣品置于13 500 r/min下冷凍離心15 min后，采用“2.1”項下的HPLC法測定藥物含量，計算單位面積累積滲透量（Q，圖9）。

Ci表示為第i個時間點測定的藥物質量濃度（mg/mL），Vi表示為第i個時間點的取樣體積（mL），CnVn表示為第i－1個時間點的總藥物滲透量，A則為接收池面積（cm2），本實驗中，V＝3 mL，A＝3.14 cm2

對2種凝膠在18 h內的經皮滲透的單位面積累積滲透量（18）進行計算，結果詳見表14，Bai-LiP- Gels在18 h的單位面積累積滲透量（81.38±2.81）μg/cm2遠高于Bai-Sus-Gels的（43.03±2.14）μg/cm2，Bai-LiP-Gels在累積透皮率上更加優異。對Bai-Lip- Gels和Bai-Sus-Gels的單位面積累積滲透曲線進行方程擬合，結果見表15，Bai-Lip-Gels的經皮滲透符合一級方程要求，而Bai-Sus-Gels經皮滲透符合零級方程。

表14 Bai-Lip-Gels與Bai-Sus-Gels各時間點的Qn (, n = 5)

2.5 對痤瘡的初步藥效學評價

2.5.1 兔耳痤瘡造模 選用清潔級雄性新西蘭兔18只，采用Kligman法造模[21]，每天用棉簽將油酸外涂抹于雙側兔耳管開口2 cm×2 cm處，每日1次，連續15 d。于涂抹油酸第3天時同時涂抹.菌液，100 μL/耳，選用處于對數生長期的.菌液。

造模第1天，兔耳柔軟，其上毛細血管清晰可見，未出現角化和粉刺狀顆粒生成；造模第7天，毛囊口隆起，有較多黑色角栓物質生成，角化現象加重，粉刺狀顆粒物增多；造模第14天，兔耳紅腫明顯，有隆起的丘疹和膿皰，表明痤瘡造模成功。見圖10。

造模結束后，分別隨機選取空白兔耳朵和模型兔耳進行染色切片，染色結果見圖11。其中造模兔耳染色切片，毛囊周圍大量細胞浸潤，真皮毛囊數量增多，周圍有炎癥細胞浸潤，表皮層增厚，角化不全等現象，表明兔耳痤瘡造模成功。

表15 Bai-Lip-Gels與Bai-Sus-Gels釋放曲線方程擬合

a-造模后第1天兔耳 b-造模后第7天兔耳 c-造模后第14天兔耳

2.5.2 分組及給藥 查閱痤瘡臨床指南，選用治療輕、中度痤瘡的一線藥物阿達帕林凝膠作為陽性對照；以空白脂質體凝膠作為陰性組。

A-空白組病理學觀察 B-痤瘡造模組病理學觀察，圖B中為毛囊口，為表皮層，為角質層

18只清潔級雄性新西蘭兔，質量2.0～2.5 kg，適應性飼養1周后，隨機分為6組，分別為正常對照組：不采用痤瘡造模及用藥治療；模型實驗組：造模成功后，不采用任何藥物治療；Bai-Lip-Gels組、Bai-Sus-Gels組、陽性對照組和陰性對照組分別在痤瘡病損處涂抹約1 g，2次/d，治療用藥21 d。給藥結束后，每組新西蘭兔隨機選取一只進行兔耳H&E染色切片，對其給藥后的療效進行病理組織分析[22]，結果見圖12。正常組兔耳皮膚結構完整，無慢性炎癥改變；模型組細胞結構不完整，皮脂腺增大，角質化堵塞嚴重[23]，呈急慢性炎癥改變；陰性組存在大量單核細胞、中性粒細胞浸潤，呈急慢性炎癥改變；Bai-Sus-Gels組的細胞層結構紊亂，組織炎性程度較重；Bai-Lip-Gels組在組織病理形態學上與正常組較接近，角質化程度、局部組織充血、炎性程度等方面得到改善；陽性藥物組毛囊角質化依然明顯，在炎性細胞的聚集、角質化等方面有所改善。

a-正常對照組 b-模型組 c-陰性對照組 d-Bai-Sus-Gels組 e-Bai-Lip-Gels組 f-陽性對照組

2.5.3 ELISA法測定兔耳痤瘡模型血清中的炎癥因子水平 在兔耳痤瘡造模15 d時，在醫用酒精消毒條件下，取造模兔耳的耳緣靜脈血2 mL/只，隨即用低溫離心機離心5 min（4 ℃、3500 r/min），然后靜置30 min取上清液分裝于離心管中，保存在?80 ℃冰箱中待檢測。在分組給藥21 d時，分別取6組兔耳耳緣靜脈血2 mL/只，同上方法操作，低溫離心，取靜置后上清液于離心管中，在?80 ℃冰箱中保存待檢。采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測家兔兔耳痤瘡模型血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量。

（2）血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8濃度變化：由表16可知，與模型組對比，正常組和Bai-Lip- Gels組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的質量濃度水平均非常顯著性的低于模型組（＜0.001）。表明Bai-Lip-Gels能顯著性降低兔耳痤瘡的炎癥因子水平，其中陽性藥物組中血清中TNF-α的質量濃度水平非常顯著的低于模型組（＜0.001）；而陽性藥物組中IL-1β和IL-8的質量濃度水平極為顯著低于模型組（＜0.01）；陽性藥物組中IL-6的質量濃度水平則顯著低于模型組（＜0.05）。由以上統計學結果可以大致了解脂質體凝膠組與陽性藥物組對兔耳痤瘡的炎癥因子水平均有顯著性降低，但是脂質體凝膠組在降低炎癥因子質量濃度的療效更好。

表16 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平(, n = 6)

與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與正常對照組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001

*< 0.05**< 0.01***< 0.001model group;#< 0.05##< 0.01###< 0.001normal control group

3 討論

中醫認為，痤瘡的發生發展和外受風邪、毒熱互結、肝腎陰虛、沖任失調、肺經藴熱、濕熱蘊結、痰濕互結等有關。從中醫視角來研究痤瘡，形成了以“濕”“熱”為辯證核心，重點從肺、肝、脾、腎來論治的思路[25]。現階段，臨床上治療重度痤瘡以口服抗生素為主，包括異維A酸軟膠囊、多西環素片、紅霉素片等，這些藥物普遍存在著療效周期長、容易產生耐藥性、副作用多等問題。輕、中度痤瘡以局部外用藥物為主，包括阿達帕林凝膠、紅霉素軟膏等，但受阻于角質層的屏障功能，此類藥物不能持續有效透過皮膚，難以達到讓人滿意的療效。在中醫古籍中記載痤瘡治療的外用方或是內服方[26]，黃芩高頻率的作為君藥使用。與痤瘡以“濕”“熱”為辯證核心的論治思路相統一的是，中藥黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效[27]，其提取物黃芩苷是其所有提取物中最具抗炎活性的物質[2]，相關研究表明[3]，在同樣濃度下，黃芩苷對于痤瘡丙酸桿菌的抑制作用是甲硝唑的2倍左右，而與同濃度的紅霉素相比，藥效也在1.5倍以上。因此，將中藥單體黃芩苷制備成外用制劑具有較大的潛力。

通過單因素試驗考察了6個因素對Bai-Lip粒徑和包封率的影響，研究發現粒徑可以通過適宜的探超功率來控制粒徑大小，而包封率需要通過多個因素來綜合評價。在形成Bai-Lip的前提下，水化溫度越高越不利于后續的穩定性儲存，隨著儲存時間的延長，容易導致脂質體破相，藥物泄露出來。前期的預實驗以及單因素考察結果表明，40 ℃左右作為水化溫度制備樣品，在脂質體后期的穩定性試驗考察中發現是最為穩定的。

單因素考察篩選出對Bai-Lip的包封率影響較大的3個因素，可以減少Box-Behnken設計-響應面試驗的因素，減少試驗次數，得到較優的處方工藝參數。根據最優工藝參數制備的脂質體包封率較大，且實測值與預測值偏差較小，表明Box-Behnken設計-響應面具有較好的預測性，可用于Bai-Lip的處方和制備工藝的優化設計。

根據透析袋釋藥結果，選取0～18 h做離體皮膚透皮試驗，Bai-Lip-Gels在18 h內的單位面積累積滲透量能達到（81.38±2.81）μg/cm2，是Bai-Sus- Gels累積滲透量的1.88倍，并對Bai-Lip-Gels和Bai-Sus-Gels的釋放曲線進行了方程擬合，Bai-Lip凝膠體外經皮滲透規律符合一級方程，且方程擬合系數大于0.99，Bai-Sus-Gels經皮滲透規律更符合零級方程，方程擬合系數大于0.98，提示了2種制劑的釋放機制不同。

油酸堵塞兔耳毛囊，涂抹痤瘡丙酸桿菌15 d后，痤瘡模型造模成功。給藥21 d后，從組織病理染色結果來觀察脂質體凝膠組的療效比較顯著，主要體現在減輕角質化程度、局部組織充血、炎性程度等方面。通過給藥治療后，兔耳痤瘡模型血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8分泌的影響發現，Bai-Lip- Gels能顯著降低兔耳痤瘡的炎癥因子水平。說明Bai-Lip-Gels在短期治療輕、中度痤瘡具有良好的療效。

綜上所述，本實驗成功制備的Bai-Lip-Gels為治療因痤瘡丙酸桿菌引發炎癥引起的痤瘡提供了制劑的依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation, quality evaluation of baicalin liposomes gels and its pharmacodynamic evaluation for acne

WANG Jia-hui, CHEN Lin, SUN Ping, CHEN Zi-hao, LI Hai-yan, SU Qing

College of Pharmacy,Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China

To prepare baicalin liposomes gels (Bai-Lip-Gels), evaluate its quality, and investigate its efficacy in treating mild and moderate acne.Firstly, a single factor test was used to investigate the influence of the formulation process on the preparation of liposomes with the encapsulation efficiency and particle size as evaluation indicators. Secondly, the correlation between each factor and the encapsulation efficiency was used to select the significant factors affecting the preparation of liposomes, and then, the Box-Behnken effect surface method was used to further optimize the prescription process. Moreover, Bai-Lip-Gels was prepared, and characterized by rheology, and its stability was preliminarily investigated, and the drug release of Bai-Lip-Gels was investigated through the dialysis bag release test and theskin transdermal test performance. Finally, the pharmacodynamics of Bai-Lip-Gels was evaluated for rabbit ear acne.The baicalin liposomes (Bai-Lip) were successfully prepared, with an encapsulation efficiency of 63.9%; Under the transmission electron microscope, the liposomes were in a regular spherical shape, with complete structure and uniform dispersion. The particle size was (212.300 ± 0.424) nm, polydispersity index (PDI) was 0.217 ± 0.012, Zeta potential was (?32.4 ± 0.9) mV, and the prepared Bai-Lip was stable. The prepared Bai-Lip-gels had stable rheological properties and good storage stability at 4 ℃. The results ofskin permeation test showed that the cumulative permeation per unit area in 18 h (18) of Bai-Lip-Gels was (81.38 ± 2.81) μg/cm2, which was higher than18of baicalin suspension gels (Bai-Sus-Gels) which was (43.03 ± 2.14) μg/cm2, and the release curve of Bai-Lip-Gels and Bai-Sus-Gels was fitted with equations. The permeation of Bai-Lip-Gelsconformed to the first-order equation, and the transdermal permeation of Bai-Sus-Gels penetration conformed to the zero-order equation. Preliminary pharmacodynamic tests showed that the therapeutic effect of the Bai-Lip-Gels group was significant after administration treatment by histopathological staining, which was mainly reflected in the reduction of keratinization, local tissue congestion, and inflammation. From the effects of TNF-α, IL-1β, IL-6, and IL-8 secretion in the serum of rabbit ear acne model, it is found that Bai-Lip-Gels significantly reduced the level of inflammatory factors in rabbit ear acne, and the curative effect was better than Adapalene gel group.The preparation of Bai-Lip-Gels for the treatment of rabbit ear acne can effectively reduce the degree of keratinization, relieve local tissue congestion, and reduce the level of inflammatory factors, which provides a basis for the development of preparation for the treatment of mild and moderate inflammatory acne.

baicalin; liposomes gels; Box-Behnken design-response surface methodology; percutaneous permeation; acne; inflammation; pharmacodynamics

R283.6

A

0253 - 2670(2021)16 - 4860 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.011

2021-04-30

2020年四川省科技創新苗子工程培育及小發明小創造項目；2020年江安縣級科技計劃項目

王佳輝（1995—），碩士研究生，從事中藥提取物及新制劑研究。Tel: 15756327309 E-mail: 1647906146@qq.com

蘇 青，博士，副教授，研究生導師，從事中藥提取物及新制劑研究。Tel: (028)62739516 E-mail: 74359178@qq.com

[責任編輯 鄭禮勝]