經典名方旋覆代赭湯的指紋圖譜及功效關聯物質預測分析

申屠銀洪，李歡歡，趙曉莉，毛 靖，林 麗，毛春芹，李 鵬，許金國*，陸兔林*

經典名方旋覆代赭湯的指紋圖譜及功效關聯物質預測分析

申屠銀洪1，李歡歡2，趙曉莉2，毛 靖2，林 麗2，毛春芹2，李 鵬3，許金國2*，陸兔林2*

1. 浙江桐君堂中藥飲片有限公司，浙江 桐廬 311500 2. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 3. 南京海陵中藥制藥工藝技術研究有限公司，江蘇 南京 210023

基于指紋圖譜及網絡藥理學，建立旋覆代赭湯（Xuanfu Daizhe Decoction，XDD）的指紋圖譜分析方法，并對其功效關聯物質進行預測分析，為XDD質量控制提供參考依據。運用HPLC色譜法建立旋覆代赭湯物質基準對應實物（material standard corresponding material，XDD/MSCM）指紋圖譜分析方法，匹配共有峰，并對各共有峰進行歸屬分析，基于文獻及指紋圖譜篩選XDD活性成分，通過網絡藥理學建立“成分-靶點-通路”網絡，進一步佐證XDD功效成分選擇的合理性。建立了XDD/MSCM指紋圖譜分析方法，對多批次XDD/MSCM樣品進行測定，標定36個共有峰，通過對照品指認出甘草苷、1,5--二咖啡酰奎寧酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、1--乙酰旋覆花內酯、人參皂苷Rb1、甘草酸、6-姜辣素8個色譜峰，各批次樣品相似度均＞0.90，且36個共有峰均能明確歸屬到旋覆花、人參、生姜、甘草4味飲片；采用網絡藥理學對甘草苷、1,5--二咖啡酰奎寧酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、1--乙酰旋覆花內酯、人參皂苷Rb1、甘草酸、6-姜辣素8個藥效成分進行機制預測，富集的通路中含磷脂酰肌醇-3-羥激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3- hydroxykinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信號通路、低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號通路等與止嘔及抗炎作用相關。建立的XDD指紋圖譜分析方法穩定可行，通過歸屬分析明確色譜峰的來源，為XDD后續制劑的研究提供參照基準，且結合網絡藥理學發現XDD 8個成分與XDD功效屬性密切相關，可作為其潛在的功效關聯物質，為XDD指標成分選擇的合理性提供依據，同時為經典名方的研究提供參考。

經典名方；旋覆代赭湯；指紋圖譜；網絡藥理學；功效關聯物質；質量控制；甘草苷；1,5--二咖啡酰奎寧酸；人參皂苷；1--乙酰旋覆花內酯；甘草酸；6-姜辣素；旋覆花；人參；生姜；甘草；PI3K-Akt；HIF-1

經典名方是指來源于古代中醫典籍收載的至今仍廣泛應用且療效確切的中藥方劑，彰顯了中醫藥治療疾病的獨特優勢。為了全面利用中醫藥財富服務于人類健康，2018年國家中醫藥管理局發布《古代經典名方目錄（第一批）》[1]，并以《古代經典名方中藥復方制劑及其物質基準的申報資料要求（征求意見稿）》（以下簡稱《申報資料要求》）[2]指導經典名方的開展。

經典名方的研究主要集中在如何還原古方原貌，并對其進行全面的質量控制。為了加強對經典名方的質量監管，要求創建“藥材-飲片-物質基準對應實物（material standard corresponding material，MSCM）-制劑”全過程的質量控制措施，指紋圖譜被列為評價中藥的重要方法。

旋覆代赭湯（Xuanfu Daizhe Decoction，XDD）出自東漢張仲景《傷寒論》一書，全方由旋覆花、人參、生姜、代赭、甘草（炙）、半夏（洗）、大棗（擘）7味藥組成，具有降逆化痰、益氣和胃之功[3]，現代藥理研究表明其具有止嘔、抗炎等作用[4]。本實驗按照《申報資料要求》旨在建立旋覆代赭湯物質基準對應實物（XDD/MSCM）指紋圖譜分析方法，并對共有峰進行歸屬分析，明確飲片與MSCM的內在關聯，以期形成穩定可行的物質基準質量標準，并結合網絡藥理學技術構建“成分-靶點-通路”網絡，分析XDD質量控制指標選擇的合理性，探索XDD潛在的功效關聯物質，為XDD質量控制及制劑的進一步研究提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，配四元低壓梯度泵，在線脫氣裝置，自動進樣器，DAD檢測器，色譜工作站，美國安捷倫公司；MS-105D電子天平，梅特勒-托利多集團；TD1002C電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；MG-H21S011多功能電陶爐，廣東美的生活電器制造有限公司；HH-2K4恒溫水浴鍋，鞏義市英峪予華儀器廠；KQ-500B超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；H1650-W臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；砂鍋，江西舒雅陶瓷有限公司。

1.2 試藥

試劑：乙腈，HPLC級，德國Merck公司；磷酸，HPLC級，阿拉丁試劑有限公司；甲醇，HPLC級，江蘇漢邦科技有限公司；甲醇，分析純，山東禹王實業有限公司化工分公司；正丁醇，分析純，上海申博化工有限公司；水為娃哈哈純凈水。

對照品：甘草苷（批號P25J7F18328，質量分數≥95%）、1,5--二咖啡酰奎寧酸（批號P26F9F54633，質量分數≥98%），上海源葉生物科技有限公司；甘草酸單銨鹽（批號110731-202021，質量分數≥96.2%）、6-姜辣素（批號111833-201806，質量分數≥99.9%）、人參皂苷Rg1（批號110703-201832，質量分數≥93.4%）、人參皂苷Re（批號110754-201827，質量分數≥93.9%）、人參皂苷Rb1（批號110704- 201827，質量分數≥93.1%），中國藥品生物制劑檢定研究院；1--乙酰旋覆花內酯（批號CFS201802，質量分數≥98%），武漢天植物技術有限公司。

XDD 7味原料藥材各采集不少于3個產地，每個產地不少于5批，總批次不少于15批，經南京中醫藥大學研究生院陳建偉教授鑒定旋覆花為菊科植物旋覆花Thunb的干燥頭狀花序；人參為五加科植物人參C. A. Mey.的干燥根和根莖；生姜為姜科植物姜Rosc.的新鮮根莖；代赭石為氧化物類礦物剛玉族赤鐵礦，主含Fe2O3；甘草為豆科植物甘草Fisch的干燥根和根莖；半夏為天南星科植物半夏(Thunb.) Breit的干燥塊莖；大棗為鼠李科棗屬植物棗Mill的干燥成熟果實[5]。按照《中國藥典》2015年版各藥材項下檢測方法進行檢測，均符合藥典標準，并結合資源考證優選藥材產地，最終優選的各藥材產地分別為旋覆花（山東東平）、人參（吉林撫松）、生姜（云南蒙自）、代赭石（河北宣化、河北平山）、甘草（甘肅民勤）、半夏（江蘇泰州）、大棗（山東新泰）。

本實驗結合前期研究及《中國藥典》2015年版及全國炮制規范指導下優化的炮制工藝參數，其中甘草（炙）為炒甘草，半夏（洗）為姜半夏。將優選產地的藥材炮制成對應的15批飲片，飲片經檢查均符合《中國藥典》2015年版各飲片項下標準，利用Excel中RANDBETWEEN函數生成隨機數，將旋覆花、人參、生姜、代赭石、甘草、姜半夏、大棗7味飲片的不同批次隨機組合制備XDD/MSCM，批次組合具體信息見表1。

表1 XDD/MSCM隨機組合

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

按處方量分別稱取旋覆花9 g，人參6 g，生姜15 g，代赭石3 g，甘草9 g，姜半夏7.5 g，大棗12 g的各味飲片，加水2000 mL，浸泡60 min，以武火（2200 W）煮沸后，半開蓋，調節火力至1000 W，保持微沸并煮至1200 mL，趁熱用100目篩濾過，濾液繼續煎煮至600 mL，放冷，即得XDD/MSCM。

取XDD/MSCM 10 mL，精密量取，正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，加甲醇溶解至2 mL，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

取各對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成含甘草苷318.0 μg/mL、甘草酸121.2 μg/mL、6-姜辣素44.0 μg/mL、1,5--二咖啡酰奎寧酸132.3 μg/mL、1--乙酰旋覆花內酯39.6 μg/mL、人參皂苷Rg1412.0 μg/mL、人參皂苷Re 436.0 μg/mL、人參皂苷Rb1407.2 μg/mL混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，5%～15%乙腈；10～15 min，15%～21%乙腈；15～25 min，21%～22%乙腈；25～28 min，22%～25%乙腈；28～52 min，25%～28%乙腈；52～60 min，28%～36%乙腈；60～75 min，36%～43%乙腈；75～90 min，43%～46%乙腈；90～95 min，46%～58%乙腈；95～103 min，58%～70%乙腈；103～113 min，70%～95%乙腈；113～115 min，95%～5%乙腈；體積流量1 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取XDD/MSCM供試品溶液，重復進樣6次，記錄指紋色譜圖。以峰型最佳且穩定的30號峰（6-姜辣素）為參照峰，各個共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.11%，相對峰面積RSD值均小于3.31%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取XDD/MSCM供試品溶液，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進樣HPLC分析，記錄指紋色譜圖。以30號峰（6-姜辣素）為參照峰，各共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.09%，相對峰面積RSD值均小于7.57%，表明該方法的重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 分別取XDD/MSCM供試品溶液，室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，在上述色譜條件進行HPLC分析，記錄指紋色譜圖。以30號峰（6-姜辣素）為參照峰，各個共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.22%，相對峰面積RSD值均小于3.55%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5 XDD/MSCM指紋圖譜建立及相似度評價

按照“2.1”項下方法制備18批XDD/MSCM供試品溶液，并按“2.3”項下色譜條件進樣，并記錄色譜圖。色譜圖依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012A）軟件。以S1號樣品的指紋圖譜作為參照譜，采用中位數法，進行多點校正和色譜峰匹配，得到18批樣品疊加圖及共有模式圖，結果見圖1、2-A。確定了36個共有峰，經與化學對照品（圖2-B）的色譜行為進行比較，可鑒定出其中8個色譜峰，分別為7號峰甘草苷、14號峰1,5--二咖啡酰奎寧酸、19號峰人參皂苷Rg1、20號峰人參皂苷Re、22號峰1--乙酰旋覆花內酯、25號峰人參皂苷Rb1、29號峰甘草酸、30號峰6-姜辣素。

與對照指紋圖譜相比為參照圖譜，設其相似度為1.000，計算18批XDD/MSCM的相似度，結果見表2，各批次樣品指紋圖譜相似度大于0.90，得到的XDD/MSCM指紋圖譜相似度良好，表明各批次的物質群基本一致，上述方法穩定、可行，形成的物質基準對照圖譜能夠作為衡量XDD制劑的標準參照物。

圖1 18批XDD/MSCMHPLC指紋圖譜疊加圖

7-甘草苷 14-1,5-O-二咖啡酰奎寧酸 19-人參皂苷Rg1 20-人參皂苷Re 22-1-O-乙酰旋覆花內酯 25-人參皂苷Rb1 29-甘草酸 30-6-姜辣素

表2 18批XDD/MSCM指紋圖譜相似度

2.6 XDD/MSCM共有峰的歸屬研究

按供試品制備方法，分別制備單味飲片供試品溶液、缺單味飲片供試品溶液及XDD/MSCM供試品溶液，按照“2.3”項下指紋圖譜條件進行檢測，分別將7味飲片單味飲片供試品溶液、缺單味飲片供試品溶液和XDD/MSCM供試品溶液色譜圖進行比對，XDD/MSCM指紋圖譜中共有20個峰來自旋覆花，XDD/MSCM指紋圖譜中共有3個峰來自人參，XDD/MSCM指紋圖譜中共有3個峰來自生姜，XDD/MSCM指紋圖譜中共有14個峰來自甘草，XDD/MSCM指紋圖譜未有峰來自代赭石、姜半夏、大棗，結果見圖3。

對XDD/MSCM進行飲片歸屬分析，結果見表3，XDD/MSCM指紋圖譜中36個共有峰，經對照品指認明確8個色譜峰，分別為7號峰甘草苷、14號峰1,5--二咖啡酰奎寧酸、19號峰人參皂苷Rg1、20號峰人參皂苷Re、22號峰1--乙酰旋覆花內酯、25號峰人參皂苷Rb1、29號峰甘草酸、30號峰6-姜辣素，且36個峰可以在原料飲片中找到明確歸屬，分別為1、3～5、8～17、22～24、26、27、34號峰來自旋覆花；19、20、25號峰來自人參；30、35、36號峰來自生姜；2、6、7、16～18、21、27～29、31～33、35號峰來自甘草；其中16、17、27號峰為旋覆花與甘草所共有，35號峰為甘草與生姜所共有，表明XDD/MSCM的主要物質群均可清晰地追溯到飲片歸屬明確。

從色譜峰個數與峰強度看，旋覆花與甘草對指紋圖譜的貢獻最大，方中人參主要含皂苷類物質，為末端吸收，在本指紋圖譜條件下只能檢出3個色譜峰，生姜主要含揮發油和姜辣素，在本指紋圖譜條件下只能檢出3個色譜峰，代赭石是礦物藥，不適用于紫外下檢出，姜半夏主要含淀粉、氨基酸，而且由于經過沸水多次泡洗，其中水溶性成分有不同程度的損失，在水煎液中含量極少，大棗中指標性成分齊墩果酸、白樺脂酸等物質極性較小，由飲片轉移至水煎液的量極少，且多糖、氨基酸類物質，在此色譜條件下不能檢出色譜峰。因此，代赭石、姜半夏、大棗3味飲片，為本實驗條件下難以獲得的指紋圖譜信息。

圖3 XDD色譜峰歸屬色譜圖

表3 XDD/MSCM共有峰歸屬

2.7 基于網絡藥理學的XDD功效關聯物質預測分析

2.7.1 基于可測性及可溯性的活性成分篩選 根據文獻研究，旋覆花為XDD君藥，其主要活性成分為倍半萜及有機酸類化合物[6]，包含1--乙酰旋覆花內酯、旋覆花素及1,5--二咖啡先奎寧酸等成分[7-8]，具有抗腫瘤、抗炎等藥理活性[9-10]；人參的主要活性成分為人參皂苷，包含人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rf等[11-12]，具有抗炎、抗癌、抗抑郁和增強記憶力等作用[13-14]；生姜中含6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚等姜辣素類主要活性成分[15]，具有抗氧化、改善脂質代謝、抗炎、抗腫瘤、降血糖等活性[16-17]；甘草的化學成分以黃酮類和三萜類為主[18]，甘草苷及甘草酸分別具有清熱解毒、抗炎鎮咳的功效[19]；代赭石主要含有鐵元素，是良好的補鐵劑[20]；半夏主含生物堿及氨基酸類[21]；大棗的化學成分以多糖為主[22]。藥典標準項下XDD組方藥味的質量控制指標為人參中的人參皂苷Rg1、Re、Rb1，生姜中的6-姜辣素，甘草中的甘草苷和甘草酸，另外，旋覆花、代赭石、半夏及大棗無質量控制指標，僅以藥典項下的質量控制指標作為XDD的指標選擇難以全面反映復方的整體特征及療效。基于文獻研究結合指紋圖譜的可測性及可溯性，確定指紋圖譜所指認的甘草苷、1,5--二咖啡酰奎寧酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、1--乙酰旋覆花內酯、人參皂苷Rb1、甘草酸、6-姜辣素等8個活性成分為候選化合物。通過Pubchem Compound化合物數據庫（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取8個候選化合物的Canonical SMILES編號，為后續XDD“成分-靶點-通路”的網絡構建做準備。

2.7.2 XDD活性靶點預測 將8個成分的Canonical SMILES號分別導入Swiss Target Prediction（http:// www.swisstargetprediction.ch/）結合Drug Bank（https://www.drugbank.ca/）及BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數據庫，篩選8個成分的作用靶點，通過Uniprot（https://www. uniprot.org/）數據庫進行靶點蛋白和基因信息校正，篩選出物種為“homo sapiens”的靶點，即為8個成分的潛在靶點，最終獲得8個化合物共涉及87個作用靶點蛋白（共計120次）。

將獲得的87個靶點蛋白上傳至STRING 11.0在線分析數據庫（https://string-db.org），選擇物種為“homo sapiens”，選取最高置信度蛋白交互參數評分值＞0.9的蛋白互作數據，篩選到49個靶點，將結果以TSV文本格式導入Cytoscape 3.7.1軟件構建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，見圖4，并利用Cytoscape 3.7.1軟件中的“Network Analyzer”功能對PPI網絡進行拓撲屬性分析，計算選取介數中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）和度值（degree）3個重要拓撲參數均大于中位數的靶點作為核心靶點，經篩選得到11個關鍵作用靶點，見表4，其中度（degree）值最高的STAT3能與16個蛋白發生相互作用。

圖4 蛋白-蛋白相互作用 (PPI)網絡

2.7.3 XDD活性成分京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 采用David v 6.7數據庫對49個作用靶點進行KEGG生物通路富集分析，根據＜0.05、FDR＜0.05篩選出22條，見圖5，包含癌癥通路、花生四乙烯代謝通路、環磷酸腺苷（cyclic AMP，cAMP）信號通路、磷脂酰肌醇-3-羥激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路及低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號通路等，表明49個靶點可能通過調控這些通路發揮治療疾病效果。

2.7.4 “成分-靶點-通路”網絡構建及分析 將篩選到的XDD8個活性成分、87個作用靶點、22條信號通路運用Cytoscape 3.7.1軟件構建“成分-靶 點-通路”網絡，見圖6。由圖6可知，XDD中8個活性成分通過作用于多靶點在不同的信號通路中發揮作用，且成分、靶點、通路間存在錯綜復雜的關系，顯示了中藥復方治療疾病作用機制的復雜性。

表4 PPI網絡中的關鍵節點及其拓撲學性質

圖5 XDDKEGG通路富集結果

2.7.5 整合分析 經典名方XDD主治胃虛痰阻氣逆證，具有降逆化痰、益氣和胃的之功，現代藥理研究表明其具有止嘔及抗炎等功效，臨床主要用于治療反流性食管炎[23-24]、膽汁反流性胃炎[25]、頑固性呃逆[26-27]、化療后嘔吐[28]、慢性咽炎[29]、美尼爾綜合征[30]等疾病，本研究基于可測性及可溯性篩選到甘草苷、1,5--二咖啡酰奎寧酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、1--乙酰旋覆花內酯、人參皂苷Rb1、甘草酸、6-姜辣素8個成分，在網絡數據庫中篩選到87個潛在靶點，其中置信度蛋白交互參數評分值＞0.9的蛋白互作數據有49個靶點，STAT3、PTGS2、JUN、VEGFA、MMP2、MMP9、MMP1、MMP3、HTR1A、PTAFR、STAT1共11個為關鍵靶點。其中藥物可通過抑制STAT3靶點效應以緩解炎性腸病、胃癌等所導致的嘔吐、腹瀉現象[31-32]，PTGS2靶點可作用于血管及神經系統進而緩解疼痛伴有嘔吐、胃腸道消化不良等狀況[33]，基質金屬蛋白酶（MMP）是一個蛋白酶家族，MMP1、MMP2、MMP3、MMP9等被視為損傷修復、癌癥侵襲、血管生成、正常組織重建的重要因子，研究發現抑制該家族蛋白酶的表達可改善藥物導致惡心，嘔吐，肝功能異常和血小板減少等副作用的產生[31,34]，以上靶點均與XDD臨床治療的表型相一致。

圖6 “成分-靶點-通路”網絡

XDD的主要功效為止嘔、抗炎。KEGG富集分析發現，包含癌癥通路、花生四烯酸代謝通路、cAMP信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路及HIF-1信號通路等22條通路。通過對相關的通路進行整理分析發現，其中TNF，又稱為TNF-α，是一類具有多種生物效應的細胞因子，有學者在大鼠急性反流性食管炎模型中證明了由于胃腸反流物的刺激，食管黏膜中TNF-α含量增高，并誘導中性粒細胞活化進而產生活性氧族及脂質過氧化作用，導致食管炎癥反應的發生[35]，符小聰等[36]研究發現癌癥通路、癌癥中蛋白多糖通路、PI3K-Akt信號通路、TNF及HIF-1信號通路在XDD治療反流性食管炎中具有重要作用，進一步預測XDD可通過以上通路治療反流性食管炎疾病；膽汁反流性胃炎的發生、發展與胃黏膜的炎癥反應關系密切，有研究表示膽汁反流性胃炎患者炎癥因子TNF-α亦處于高水平[37-38]，同時韓俊玲發現含旋覆花的中藥復方一方面直接作用于胃黏膜加強防御功能，亦可通過調節胃黏膜TNF-α的表達而發揮胃黏膜保護作用，對消除或減輕胃黏膜充血和水腫，炎性細胞浸潤、胃小凹增生以及腸上皮化生有良好的作用[39]，另外，花生四烯酸代謝通路是存在于血小板和胃黏膜上皮細胞的共同通路，既往研究表明，該通路脂質代謝物廣泛參與血小板功能調控，并與胃黏膜損傷與修復密切相關[40]，cAMP與膽汁反流性胃炎的治療效果呈正相關，其可以促進細胞正常代謝，抑制胃粘膜腸化，增強胃粘膜屏障作用[41]，表明XDD可能通過TNF-α、花生四烯酸、cAMP等通路治療膽汁反流性胃炎；HIF-1信號通路是通過促進HIF-1激活與有氧糖酵解中涉及的血管生成，紅細胞生成和關鍵酶的調節，參與調節平滑肌的收縮與舒張，緩解嘔吐癥狀的產生[42]，預測其在頑固性呃逆的治療中具有重要作用；PI3K-Akt信號通路途徑是人類癌癥中最常見的活化異常途徑，病理激活可以通過多種機制沿著信號通路在多個水平上發生，包括點突變，擴增和腫瘤抑制基因的失活，該途徑也是已知的抗性途徑，因為它可以被受體酪氨酸激酶和其他癌癥基因激活，PI3K-Akt抑制劑可下調PI3K-Akt途徑進而誘導癌細胞凋亡和衰老，促進血小板的生成，可以緩解化療后嘔吐等副作用癥狀的發生[43-45]，可能是XDD治療化療后嘔吐的關鍵通路。由此可見，XDD中關鍵效應成分可作用于多靶點，干預多個通路發揮止嘔、抗炎的治療效應，進而治療反流性食管炎、膽汁反流性胃炎、頑固性呃逆等疾病。

基于指紋圖譜及網絡藥理學研究，這8個成分具傳遞性及溯源性，且與XDD主治功效相關，初步預測其為XDD止嘔及抗炎的潛在功效關聯物質，為XDD的質量控制指標成分選擇的合理性提供參考依據。

3 討論

本研究考察了波長、流動相組成、體積流量、柱溫等XDD物質基準HPLC指紋圖譜色譜條件。其中，波長的選擇是本實驗考慮的重點，XDD的指紋圖譜旨在同一檢測波長體現全方的特征，并對其中的藥味進行成分表征，且同一波長檢測在單波長掃描的HPLC上均可方便檢測，保證了分析方法建立的實用性，基于現行藥典及文獻梳理，對XDD/MSCM樣品進行全波長掃描，著重考察了203、237、254、280 nm 4個條件下的波長，由于代赭石屬于礦物藥在紫外光譜中沒有特征吸收峰[46]，半夏及大棗中含氨基酸及糖類等大極性分子較多[21,47]、表征難度大，經各單味飲片煎液與MSCM樣品對比，發現在203 nm下旋覆花、人參、生姜及甘草指紋輪廓均能得到表征，因此，選擇203 nm作為XDD物質基準的波長。

XDD/MSCM提取液直接進樣，方中人參及生姜色譜峰面積較小，難以達到檢測線，若進行濃縮則易造成雜質殘留，鑒于此原因，選擇以正丁醇萃取，并進行5倍濃縮進行供試品溶液制備，同時經比對甲醇、乙醇、正丁醇3種溶劑，色譜峰僅在前3 min出現差異，且甲醇及乙醇制備得到的樣品色譜峰基線不及正丁醇，且考慮到處方中人參占比較低，較低的峰面積在紫外檢測中容易產生誤差，使得檢測結果不穩定，因此最終確定以正丁醇為溶劑，對樣品進行濃縮為供試品制備方法。

通過建立XDD/MSCMHPLC指紋圖譜，首次全面表征了經典名方旋覆代赭湯的整體樣貌，同時對比MSCM樣品與各飲片單煎液及缺單味飲片陰性煎液樣品，明晰共有峰的歸屬，在歸屬分析中某些共有峰為多味飲片所共有，進一步表明中藥化學成分及復方配伍的復雜性。

同時將網絡藥理學與指紋圖譜相結合，運用網絡數據庫建立“成分-靶點-通路”網絡拓撲結構，揭示XDD功效關聯性的物質基礎，同時，為XDD發揮止嘔、抗炎作用機制的闡釋提供了思路，為XDD質量控制指標成分選擇的合理性進行了驗證。

本研究所建立的XDD/MSCM HPLC指紋圖譜分析方法，以普適性及科學性較高的液相色譜為技術手段，綜合考慮各味飲片的特性，對復方整體化學輪廓進行表征，建立XDD/MSCM指紋圖譜質量控制方法，并結合網絡藥理學對其止嘔及抗炎的功效關聯物質進行了預測，為XDD整體質量控制及后續的制劑開發與研究奠定基礎，保證制劑產品達到與原方發揮臨床療效的內在一致性，同時為經典名方的質量標準研究提供參考。

方中難以獲得代赭石、姜半夏、大棗色譜峰信息，由于代赭石為礦物藥，姜半夏和大棗分別含氨基酸及多糖類成分，分析難度大，且姜半夏及大棗飲片在中藥復方的研究中均存在無法表征的難題，在研究中曾嘗試運用薄層色譜進行表征，但陰性中均存在干擾，后續研究計劃對代赭石運用原子吸收光譜測定鐵元素，將嘗試對姜半夏在大極性流動相比例中進行單獨摸索以表征其中的氨基酸類成分，對大棗中的多糖水解及衍生化處理，以體現大棗在復方中的痕跡，同時，亦可選取優質代赭石、半夏、大棗藥材，配合規范的制備過程管理，標準化的工藝參數控制其飲片質量，有助于控制XDD質量，為經典名方XDD的進一步研究提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Predictive analysis of fingerprints and efficacy related substances of classical prescription Xuanfu Daizhe Decoction

SHEN-TU Yin-hong1, LI Huan-huan2, ZHAO Xiao-li2, MAO Jing2, LIN Li2, MAO Chun-qin2, LI Peng3, XU Jin-guo2, LU Tu-lin2

1. Zhejiang Tongjuntang Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., Tonglu 311500, China 2. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 3. Nanjing Hailing of Chinese Medicine Pharmaceutical Technology Research Co., Ltd., Nanjing 210023, China

Based on fingerprints and network pharmacology, the fingerprint analysis method of Xuanfu Daizhe Decoction (旋覆代赭湯, XDD) is established, and its efficacy related substances are predicted and analyzed, which provides a reference for the quality control of XDD.HPLC method was used to establish the fingerprint analysis method of XDD material standard corresponding material (XDD/MSCM) and the common peaks were matched, at the same time, the attribution analysis of each common peak was performed. The active ingredients of XDD were screened based on literature and fingerprints, and The “component-target-pathway” network was established through network pharmacology, which further supported the rationality of functional components selection for XDD.A method for fingerprint analysis of XDD/MSCM was established. The samples of multiple batches of XDD/MSCM were determined. A total of 36 common peaks were calibrated. Eight chromatographic peaks including liquiritin and 1,5-di--caffeoylquinic acid, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, 1--acetyl britannilactone, ginsenoside Rb1, glycyrrhizic acid, 6-gingerol could be determined by reference substance. The similarity of the sub-samples were > 0.90, and the 36 common peaks could be clearly assigned to four pieces of Xuanfuhua (), Renshen (et), Shengjiang (), and Gancao (et). The mechanism of eight medicinal ingredients of liquiritin and 1,5-di--caffeoylquinic acid, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, 1--acetyl britannilactone, ginsenoside Rb1, glycyrrhizic acid, 6-gingerol was predicted by network pharmacology, and the enriched pathway contained phosphatidylinositol- 3-hydroxykinase-protein kinase B (PI3K-Akt) signaling pathway, hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) signaling pathway related to anti-vomiting and anti-inflammatory effects.The fingerprint analysis method of XDD established in this study is stable and feasible. The source of the chromatographic peaks is clarified through the attribution analysis, which provides a reference for the study of subsequent preparations of XDD. In addition, combined with network pharmacology, it was found that eight components were closely related to the efficacy properties of XDD, which could be used as potential efficacy related substances, providing a basis for the rationality of the selection of index components of XDD, and providing a reference for the study of classical formulas.

classical prescription; Xuanfu Daizhe Decoction; fingerprint chrom-atography; network pharmacology; efficacy related substances; quality control; liquiritin; 1,5-di--caffeoylquinic acid; ginsenoside; 1--acetyl britannilactone; glycyrrhizic acid; 6-gingerol;;et;;et; PI3K-Akt; HIF-1

R283.6

A

0253 - 2670(2021)16 - 4825 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.007

2021-03-31

國家重點研發計劃（2018YFC1707000）；南京市棲霞區產學研合作及科技成果轉化項目

申屠銀洪，男，執業中藥師，主要從事中藥及飲片質量標準研究管理。E-mail: st.yh@163.com

許金國，男，高級實驗師，主要從事中藥炮制及中藥飲片質量標準研究。E-mail: 300024@njucm.edu.cn

陸兔林，男，教授，博士生導師，主要從事中藥炮制及中藥飲片質量標準研究。E-mail: ltl2021@njucm.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]