磁固相萃取聯合熒光法測定生物樣品中的卡維地洛

秦艷芳，趙冰欣，李曉姣，徐風云，吳 昊*

（1.長治幼兒師范高等專科學校，山西 長治046000；2.山西師范大學 化學與材料科學學院，山西 臨汾041004）

卡維地洛（Carvedilol，CAR，圖1）屬于α和β受體阻斷劑，可擴張血管，保護心肌和神經元，在臨床上廣泛用于高血壓、心絞痛和心力衰竭等疾病的治療，能顯著降低心血管患者的發病率和死亡率［1－2］。

圖1 卡維地洛的結構式Fig.1 The structure of carvedilol

磁固相萃取（MSPE）是21世紀發展起來的一項新型固相萃取技術，與傳統的固相萃取相比，具有操作簡便快速、成本低等優點［3－4］。共價有機骨架材料（COFs）是一類由輕質元素通過共價鍵連接的新型多孔有機材料，具有化學和熱穩定性良好、比表面積大和孔徑可控等優點［5］，在樣品預處理領域具有廣闊的應用前景［6］。

本研究采用Fe3O4納米材料、1，3，5-三甲基間苯三酚（Tp）和聯苯胺（BD），通過溶劑熱法合成了Fe3O4＠COF（TpBD）復合材料。相比已有文獻［7］，其合成方法所用試劑少，過程簡單易操作，實驗成本低。以Fe3O4＠COF（TpBD）為MSPE吸附劑聯合熒光分光光度法建立了一種檢測血漿和尿液中的CAR含量的新方法，通過優化相關實驗參數，在最優實驗條件下對該分析方法進行了評估。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

FeCl3·6H2O、乙二醇、無水乙酸鈉、1，2-乙二胺、1，3，5-三甲基間苯三酚（Tp）、聯苯胺（BD）（上海阿拉丁生化科技有限公司）；無水乙醇、冰醋酸、高效液相色譜級甲醇、乙醇、乙腈（北京百靈威科技有限公司）；CAR標準物質（中國藥品生物制品檢定所）；尿液及血漿取自長治幼兒師范高等專科學校校醫院。

Cary Eclipse熒光分光光度計（Agilent Technologies，美國）；pHS－3C pH計（上海強生科技有限公司）；KQ－500DV超聲波洗滌器（江蘇昆山禾創超聲儀器有限公司）；JEM－2100透射電子顯微鏡（TEM）（JEOL，日本）；D8 Advance X射線衍射儀（XRD）（Bruker，德國）；7407振動樣品磁強計（Lake Shore，美國）；FT－IR360傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）（Nicolet，美國）；ASAP 2020比表面和孔隙度分析儀（Micromeritics，美國）。

熒光測量條件：（25±0.5）℃；λex=240 nm，λem=356 nm；激發和發射狹縫寬度為5 nm；掃描速度為1 000 nm·min-1。

1.2 磁性材料Fe3O4＠COF（TpBD）的制備

Fe3O4納米材料參照文獻［4］制備：將1.0 g FeCl3·6H2O分散于20 mL乙二醇中超聲處理，隨后緩慢加入3.0 g無水乙酸鈉，磁力攪拌30 min；加入10 mL 1，2-乙二胺攪拌30 min后，將混合溶液移至高壓反應釜中加熱至200℃并保持8 h，自然冷卻至室溫。最后將黑色產物用去離子水和乙醇洗滌數次，并在真空烘箱中60℃干燥24 h。

Fe3O4＠COF（TpBD）復合材料通過溶劑熱法制備：取60 mg Fe3O4加至30 mL無水乙醇中超聲分散，然后依次加入63 mg（0.3 mmol）Tp和55.2 mg（0.3 mmol）BD，混合物超聲35 min后，移至高壓反應釜中加熱至180℃，保持48 h。最后將產物用去離子水和乙醇洗滌數次，并在真空烘箱中60℃干燥24 h。

1.3 樣品處理

CAR標準溶液（0.1 mg/mL）：精確稱取10 mg CAR，加1 mL的冰醋酸溶解，再加適量超純水定容至100 mL。

血樣處理：在具塞離心管中依次加入10 μL不同質量濃度的CAR標準溶液、2.0 mL血漿和8 mL乙腈脫蛋白，以4 000×g離心15 min。收集透明的上清液，待測。

尿樣處理：在具塞離心管中依次加入10 μL不同質量濃度的CAR標準溶液和10 mL新鮮人尿，4 000×g離心10 min。收集透明的上清液，待測。

1.4 磁固相萃取過程

準確稱取5 mg吸附劑Fe3O4＠COF（TpBD）置于50 mL含CAR樣品溶液的比色管中，超聲4 min，將釹鐵硼磁鐵置于比色管底部對吸附劑進行分離，棄去上清液后，將吸附劑在40℃氮氣中吹干。然后準確量取0.5 mL乙醇置于比色管底部進行解吸，超聲5 min后使用釹鐵硼磁鐵分離解吸劑和吸附劑，重復解吸步驟2次，合并兩次解吸劑。最后將解吸劑用0.22 μm的針式過濾器過濾，濾液用于熒光分析。

2 結果與討論

2.1 Fe3O4＠COF（TpBD）表征

利用TEM分別對Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的形貌進行了表征。如圖2A與圖2B所示，Fe3O4呈球形，且大小均勻，表面被COF（TpBD）均勻包裹。元素分布圖像（圖2C）也表明Fe3O4＠COF（TpBD）中Fe3O4（元素Fe、O）和COF（TpBD）（元素C、N、O）均勻緊密地結合。

由Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的N2吸附－解吸等溫線（圖2D）可知，Fe3O4的BET比表面積和孔體積分別為11.00 cm2/g和0.14 cm2/g，Fe3O4＠COF（TpBD）的分別為32.26 cm2/g和0.18 cm3/g，相比Fe3O4均明顯增加。

Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的磁化曲線（圖2E）表明，兩者均具有良好的磁性能，Fe3O4＠COF（TpBD）的飽和磁化強度為27.7 emu/g，在外磁場作用下容易分離。

從Fe3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的XRD譜圖（圖2F）可以看到，Fe3O4有6個特征峰（2θ＝30.1、35.3、43.1、53.2、57.0、62.4）分別對應于（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面，COF（TpBD）在2θ＝25.5處的特征峰對應其（001）晶面。Fe3O4＠COF（TpBD）圖譜中這兩種材料的峰都有體現，說明二者形成了復合材料，同時結晶度未發生變化。

如Fe3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的FT－IR譜圖（圖2G）所示，Fe3O4＠COF（TpBD）在584 cm-1處的吸收帶為Fe—O振動，3 432 cm-1和1 442 cm-1處的吸收帶分別是O—H基團和芳香C====C單元的特征拉伸帶，1 292 cm-1和1 605 cm-1處吸收帶分別與C—N拉伸和C====N鍵有關。表明Fe3O4已成功被COF（TpBD）包裹。

圖2 Fe3O4（A）和Fe3O4＠COF（TpBD）（B）的TEM圖，Fe3O4＠COF（TpBD）的元素分布圖（C），Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的N2吸附－解吸等溫線（D），Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的磁化曲線（E），Fe3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的XRD圖譜（F）以及Fe3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的FT－IR圖譜（G）Fig.2 TEM images of Fe3O4 nanocrystal clusters（A）and Fe3O4＠COF（TpBD）（B），element mapping images of Fe3O4＠COF（TpBD）（C），N2 adsorption－desorption isotherms of Fe3O4 and Fe3O4＠COF（TpBD）（D），magnetic curves of Fe3O4 and Fe3O4＠COF（TpBD）（E），XRD spectra of Fe3O4，COF（TpBD）and Fe3O4＠COF（TpBD）（F），and FT－IR spectra of Fe3O4，COF（TpBD）and Fe3O4＠COF（TpBD）（G）

2.2 實驗條件優化

2.2.1 pH值溶液的pH值會對藥物與吸附劑間的吸附平衡產生影響。實驗中溶液的pH值用B-R緩沖溶液調節。在溶液pH 2.0～12.0范圍內進行MSPE和熒光檢測。結果如圖3A所示，隨pH值的升高，CAR的熒光強度變化不大。為了方便操作，實驗選擇萃取溶液的pH值為6.0。

2.2.2 吸附劑用量考察了吸附劑用量在1～8 mg范圍內對熒光強度的影響（圖3B）。結果表明，當吸附劑用量為5 mg時，CAR的熒光強度最大。因此，實驗選用5 mg吸附劑。

2.2.3 萃取時間考察了萃取時間為1～10 min時對CAR熒光強度的影響（圖3C）。結果顯示，熒光強度隨著萃取時間的延長逐漸增加，當萃取時間為4 min時，CAR的熒光強度達到最大值，吸附過程達到平衡。因此，萃取時間確定為4 min。

2.2.4 解吸條件分別考察了乙酸、甲醇、乙醇和乙腈4種有機溶劑對CAR的解吸效果（圖3D）。當選用乙醇為解吸劑時CAR的熒光強度最大。并考察了乙醇用量（0.2～0.8 mL）對CAR熒光強度的影響（圖3E）。結果表明，改變乙醇用量，CAR的熒光強度變化不明顯，為了方便操作，選用乙醇的體積為0.5 mL。另外，采用0.5 mL乙醇為解吸劑，考察了解吸時間在1～10 min范圍內時對CAR熒光強度的影響（圖3F）。結果表明，解吸時間為5 min時，CAR熒光強度最大。故選擇最佳解吸時間為5 min。

圖3 溶液pH值（A）、吸附劑的用量（B）、萃取時間（C）、解吸劑（D）、解吸劑的體積（E）和解吸時間（F）對CAR熒光強度的影響Fig.3 Effects of sample solution pH value（A），adsorbent amoun（tB），adsorption time（C），desorption solvent types（D），desorption solution volume（E）and desorption time（F）

2.3 方法選擇性

在優化實驗條件下，考察了某些共存物質以及常見離子對CAR（10 ng/mL）測定的影響。控制測量誤差在±5%以內，1 000倍的尿素，800倍的Mg2+，700倍的K+、HPO42-，600倍的Na+、SO42-，400倍的Cl-，160倍的Ac-，120倍的Ca2+，56倍的Al3+，8倍的Cu2+等不會對測定造成干擾。可見該方法具有很好的選擇性。

2.4 方法分析

在最優實驗條件下，制備了一系列CAR溶液，以熒光強度（y）對質量濃度（x，ng/mL）繪制標準工作曲線，線性回歸方程為y＝8.138x+4.555，R＝0.999 2。結果表明方法在1～100 ng/mL質量濃度范圍內呈良好線性。CAR的檢出限（S/N＝3）為0.19 ng/mL，定量下限（S/N＝10）為0.63 ng/mL，對溶液中CAR的富集倍數為113倍。可見該方法的靈敏度高，線性范圍寬。

為考察方法的重現性，按照磁固相萃取步驟對1 ng/mL CAR標準溶液于日內和日間進行6次平行測定。計算結果表明，其日內相對標準偏差（RSD）為3.4%，日間RSD為3.6%。

2.5 樣品分析

為了驗證本方法的可行性及有效性，在尿樣和血樣中分別加入高、中、低3種不同質量濃度的CAR標準溶液，經“1.3”方法處理后，按照磁固相萃取過程進行加標回收實驗。回收率測定結果如表1 所示，其范圍為95.9%～98.7%。說明方法的準確性較好，可有效測定尿樣和血樣中CAR的含量。

表1 加標尿樣和加標血樣中CAR的熒光測定（n＝3）Table 1 Fluorimetric determination of CAR in spiked urine and spiked plasma（n＝3）

2.6 方法比較

相比其他文獻方法（表2），本文所建立的方法線性范圍寬，在加標樣品中回收率高。

表2 生物樣品中CAR檢測方法比較Table 2 Comparison of determination for CAR in biological samples

3 結論

本研究合成了Fe3O4＠COF（TpBD）復合材料，并以Fe3O4＠COF（TpBD）作為MSPE吸附劑，聯合熒光分光光度法建立了一種檢測CAR含量的新方法。結果表明，該方法檢測范圍寬、靈敏度高且回收率好，適用于尿樣和血樣中CAR含量的測定。