吸附伏安法對輔酶Q10的測定研究

劉昱宏，郭 斌，屠一鋒

（1.錦州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 錦州121000；2.蘇州大學(xué) 材料與化學(xué)化工學(xué)部，江蘇 蘇州215123）

輔酶Q10（CoQ10），又名癸烯醌、泛醌，分子量863.36，是輔酶Q的一種。輔酶Q擁有一條由6～10個異戊二烯所構(gòu)成的側(cè)鏈，而輔酶Q10的此側(cè)鏈的聚合度為10［1］。輔酶Q10分別以泛醌（氧化形態(tài)）和泛醇（還原形態(tài)）分布在細(xì)胞膜上，主要負(fù)責(zé)電子、質(zhì)子運輸，在三磷酸腺苷的合成上起著至關(guān)重要的作用［2］，也是為心肌細(xì)胞提供能量的主要成分。大量醫(yī)學(xué)研究證明心臟疾病與輔酶Q10的缺乏有關(guān)［3－5］，其在醫(yī)學(xué)和保健品領(lǐng)域主要用于強化心肌功能，是預(yù)防動脈硬化形成的最有效的抗氧化成分，也是各類心血管疾病的主要協(xié)同用藥。因此，體內(nèi)輔酶Q10的定量分析對上述疾病的防治具有重要作用。

目前，常用的輔酶Q10檢測方法有高效液相色譜（HPLC）、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS/MS）、紫外－可見分光光度（UV－Vis）等方法，現(xiàn)行的《中華人民共和國藥典》2015版采用色譜法［6－11］，近年來也報道了一些新的、高效的檢測方法。Temova等［12］使用HPLC－UV方法測定藥物和補劑中的輔酶Q10含量，首次實現(xiàn)同步測定輔酶Q10和其他5種脂溶性維生素。Schou－Pedersen等［13］研究了相同條件下HPLC－ECD和LC－MS/MS兩種方法對輔酶Q10的測定靈敏度，HPLC－ECD表現(xiàn)出色，定量檢出限（LLOQ）低至10 nmol/L。但所有聯(lián)用HPLC分離的檢測方法所需時間普遍較長，儀器成本和使用成本均較高，不利于普及應(yīng)用。

本文使用吸附伏安法對輔酶Q10進行測定，發(fā)現(xiàn)利用輔酶Q10在玻碳電極上的吸附作用，可有效提高其測定靈敏度。在單因素分析基礎(chǔ)上使用Box－Behnken實驗設(shè)計對測定條件進行優(yōu)化，獲得檢出限為19.0 nmol/L，接近HPLC法水平。在達3個數(shù)量級的濃度范圍內(nèi)，吸附伏安電流和輔酶Q10濃度的對數(shù)呈線性相關(guān)，可用于輔酶Q10的定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ALS/DY2325 Bi－potentiostat電化學(xué)工作站（日本比·艾斯公司），三電極體系：工作電極為玻碳電極（φ=3 mm），對電極為鉑電極，參比電極為飽和甘汞電極。

輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品（USP，＞98.5%，上海麥克林生化科技有限公司），使用乙醇溶解，并根據(jù)需要稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)溶液；甲醇、乙醇、硫酸（分析純，江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司）；甲醇、乙醇按一定比例混合并加入0.12 mol/L硫酸作為支持電解質(zhì)；用于溶解輔酶Q10的乙醇和電解質(zhì)溶液使用前均通氮氣除氧5 min，以防止還原態(tài)輔酶Q10被氧化；實驗用水均為去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 吸附伏安測試條件在－0.2～0.6 V范圍內(nèi)，以不同掃描速率進行循環(huán)伏安（CV）掃描，以所得峰電流和掃速之間關(guān)系判斷輔酶Q10電化學(xué)反應(yīng)的控制步驟，依據(jù)研究結(jié)果優(yōu)化相關(guān)測試參數(shù)（如預(yù)富集時間、溫度、支持電解質(zhì)溶液組成以及樣品制備條件等）。

1.2.2 實際樣品的處理測試樣品為輔酶Q10膠囊和軟膠囊，由藥店隨機購得。輔酶Q10膠囊顆粒狀內(nèi)容物用乙醇超聲溶解并定容，輔酶Q10軟膠囊內(nèi)油狀內(nèi)容物使用乙醇超聲提取，8 000 r/min離心15 min后吸取黃色上清液，反復(fù)數(shù)次直至殘渣完全呈白色，合并提取液并定容。

2 結(jié)果與討論

2.1 輔酶Q10電化學(xué)反應(yīng)機理及主要影響因素

以玻碳電極為工作電極，在－0.2～0.6 V范圍內(nèi)，考察不同掃描速率（0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 V/s）時0.5 μmol/L輔酶Q10的循環(huán)伏安曲線，以探討輔酶Q10的電化學(xué)行為。結(jié)果顯示，峰電流（I）隨掃描速率的增大而增大，且與掃描速率（v）呈線性相關(guān)，其線性方程為：I=0.216+13.1 v，r2=0.997，符合Laviron理論：Ip=nFQν/4RT，可判斷輔酶Q10在玻碳電極上的電化學(xué)反應(yīng)受吸附控制［14－18］，因此可通過預(yù)富集提高測定靈敏度。進一步考察不同預(yù)富集時間（0～45 min，間隔時間5 min）對輔酶Q10循環(huán)伏安電流的影響，顯示輔酶Q10在玻碳電極上的循環(huán)伏安峰電流值隨富集時間的延長而增強，且在富集25 min時獲得最大電流，該結(jié)果支持吸附控制電化學(xué)過程的觀點。但預(yù)富集時間過長則電流逐步下降，其原因可能是還原態(tài)的輔酶Q10被溶解氧部分氧化。

對多項測定條件進行篩選后，發(fā)現(xiàn)在制備輔酶Q10樣品溶液時宜采用超聲振蕩以加快其溶解速度并提高溶解效率，在測定時，溫度、支持電解質(zhì)溶液溶劑組成有顯著的影響，采用單因素分析法可分別對上述因素進行優(yōu)化。樣品制備時進行超聲振蕩可快速溶解輔酶Q10，但時間過長可能導(dǎo)致其形態(tài)變化，由圖1A可知，超聲溶解時間以不超過2 min為宜。由圖1B可知，測定電流值隨溫度升高呈先增加后降低的趨勢，溫度為25℃左右時，輔酶Q10的循環(huán)伏安電流響應(yīng)值最高。其原因可能是，隨著溫度升高，輔酶Q10的傳質(zhì)速度加快，有利于其在電極表面的吸附富集，而溫度過高則可能加快輔酶Q10在電極表面的脫附，從而導(dǎo)致電流值下降［19］。已有研究多使用乙醇作為溶劑對輔酶Q10進行測定［6－13］，由圖2C可知，支持電解質(zhì)溶液中溶劑構(gòu)成對輔酶Q10的電化學(xué)響應(yīng)有較為顯著的影響，本實驗以甲醇∶乙醇配比為1∶1時，獲得的電流響應(yīng)值較高。

圖1 樣品超聲時間（A）、測定溫度（B）、溶劑比例（C）對循環(huán)伏安電流的影響；樣品超聲時間不同時所得溶液的紫外吸收光譜（D）Fig.1 Effects of ultrasonic time（A），detection temperature（B）and solvent composition（C）on CV current；UV spectra of CoQ10 solution under different ultrasonic time（D）CCoQ10=0.5 μmol/L

2.2 測定條件優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果

以上單因素試驗初步揭示了相關(guān)因素的影響規(guī)律，使用Box－Behnken響應(yīng)面分析法［20－22］以考察各因素的影響及交互作用，可進一步優(yōu)化上述測定條件，因此進行3因素3水平實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。設(shè)置樣品超聲時間、測定溫度、溶劑配比分別為因素A、B、C，以3次平行測定平均值計數(shù)，得出回歸方程為：y=2.10－0.210A－0.232B+0.206C+0.239AB+0.256AC－0.170BC－0.295A2－0.795B2－0.441C2。

方程預(yù)測相關(guān)系數(shù)（Predicted R2=0.753）與修正相關(guān)系數(shù)（Adjusted R2=0.948）差值小于0.2，說明該模型的擬合程度良好，方程相關(guān)系數(shù)R2=0.977，說明模型成立。方差分析結(jié)果見表1，表明A、B、C均為顯著影響因素，且顯著性A＞B＞C。

表1 回歸模型及方差分析Table 1 The variance analysis of regression equation

對方差分析結(jié)果進行分析，可見A因素對結(jié)果有更大的顯著性影響，而A因素參與的交互作用的顯著性較小，說明A因素是一個較為獨立的因素，但與其它因素間并非完全無交互作用。參考圖1A所示實驗結(jié)果，超過2 min的超聲時間將導(dǎo)致輔酶Q10的檢測電流顯著降低，原因應(yīng)與其形態(tài)變化有關(guān)，如圖1D所示，過長的超聲時間會導(dǎo)致其UV吸收降低，這可理解為超聲時間過長會促使更多氧氣溶解進入樣品溶液中而使部分樣品逐步被氧化，這一過程會持續(xù)到檢測過程，從而與因素B、C發(fā)生交互作用。另一方面，超聲振蕩引起聲空化過程導(dǎo)致的局部溫度升高使樣品以蒸發(fā)方式損失一部分也可能是原因之一［23］。

在此基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析（圖2）可以獲得更為精確的優(yōu)化結(jié)果。

圖2 超聲時間與溫度（A）、超聲時間與溶劑比例（B）、溫度與溶劑比例（C）對輔酶Q10電流值影響的響應(yīng)面分析Fig.2 RSM analysis of the current response toward ultrasonic time and temperature（A），ultrasonic time and solvent ratio（B）and temperature and solvent ratio（C）

以上優(yōu)化得到的最佳條件為：超聲時間1.88 min，溫度23.3℃，甲醇∶乙醇溶劑配比為1.1∶1，電流值的預(yù)測值為2.176 μA。結(jié)合實際情況，調(diào)整超聲時間為1 min 50 s，溫度為25℃，溶劑配比為1.1∶1，重復(fù)4次平行測定的平均值為2.054 μA，與由回歸方程給出的理論值相吻合。證實該模型能精準(zhǔn)地反映各因素對電流值的影響，可作為玻碳電極上CV測定輔酶Q10的最優(yōu)條件。

2.3 輔酶Q10的吸附伏安響應(yīng)與分析性能

在優(yōu)化條件下測定不同濃度（0.025、0.25、0.5、1.25、2.5、12.5、25.0 μmol/L）輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)溶液的CV電流并進行回歸分析，以進行輔酶Q10的定量測定，并根據(jù)回歸方程計算檢出限（LOD）。結(jié)果顯示，其氧化峰電流隨輔酶Q10濃度的增大而增大（圖3），且與輔酶Q10濃度的對數(shù)呈線性相關(guān)，線性范圍為0.025～25.0 μmol/L，線性方程為I=2.554+1.479lgC，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.997，LOD（［lgLOD=（3SD－a）/b］）為19.0 nmol/L。取0.5 μmol/L輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測定5次，RSD為1.1%，證明該方法的精密度良好。實驗結(jié)果表明吸附伏安法可靈敏地測定輔酶Q10，與其他檢測輔酶Q10的方法相比，本方法表現(xiàn)出很好的分析性能，其線性范圍及檢出限均達到較高水平（見表2）。

表2 輔酶Q10測定方法的性能對比Table 2 Comparison for the detection performances of CoQ10 with different methods

圖3 不同濃度輔酶Q10的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms for different concentration of CoQ10

2.4 實際樣品的測定

在優(yōu)化條件下，采用CV法對3種膠囊樣品中的輔酶Q10進行測定，同時進行3種不同濃度水平的加標(biāo)回收率實驗，結(jié)果見表3。測得回收率為85.9%～109%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.0%～11%。該結(jié)果在可接受的范圍內(nèi)，說明該方法測定輔酶Q10是一種切實有效的方法。

表3 樣品中輔酶Q10的測定結(jié)果及回收率Table 3 The detected results and recoveries of CoQ10 in real samples

3 結(jié)論

本研究實現(xiàn)了輔酶Q10的吸附伏安法測定，并采用Box－Behnken響應(yīng)面方法優(yōu)化了樣品處理及測定條件為：樣品提取超聲時間為1 min 50 s，測定溫度為25℃，電解質(zhì)溶劑配比為1.1∶1的甲醇－乙醇。上述條件下，循環(huán)伏安電流與輔酶Q10濃度的對數(shù)在0.025～25.0 μmol/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，LOD為19.0 nmol/L，可對輔酶Q10進行精確的定量分析。