脫細胞豬心包膜生物相容性及成骨性能的體內外評價

尤鵬越，劉玉華，王新知，王思雯，唐 琳

(北京大學口腔醫學院·口腔醫院，修復科 國家口腔醫學中心 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室，北京 100081)

各種原因引起的牙齒缺失是口腔領域常見疾病之一,越來越多的患者首選種植治療作為修復口內缺失牙的方式，而手術的可能性及長期預后往往取決于缺牙區域的骨質及骨量[1]。引導性骨再生技術(guided bone regeneration, GBR)是目前臨床中促進牙槽骨再生的重要手段[2],它通過在骨缺損區域內填充骨替代材料，并覆蓋屏障膜將快速生長的上皮細胞及結締組織細胞隔離開來，使得具有骨再生潛能的細胞(如成骨細胞、牙周膜干細胞)更好地在缺損區域發揮成骨作用，以實現牙槽骨骨量及骨質的提升[3-4]。屏障膜的選擇是影響GBR的重要因素之一，屏障膜應具備良好的生物相容性、屏障性、一定的機械強度、易操作性等[5]。可吸收的屏障膜因其可降解性、無需二次取出、感染及暴露風險低廣受臨床醫生青睞[6]。來源廣泛的天然膠原類可吸收膜因其是細胞外基質的重要有機成分，具有凝血、募集牙周膜干細胞及牙齦成纖維細胞等功能，同時具有半透性，能夠維持營養物質交換的優勢[7]，成為應用最為廣泛的屏障膜。但一些研究發現，這類純膠原屏障膜在組織整合過程中，多核巨細胞及多形核白細胞等分泌的膠原酶加速膠原體內降解，使得再生過程具有不確定性[8]，有研究表明它在體內4周內幾乎完全降解[9-10]，因此，尋找一種降解時間更適宜骨再生進程的膠原膜成為學者們研究的重點。細胞外基質膜(extracellular matrix, ECM)應運而生，成為組織再生領域重要的生物材料。ECM膜主要由豬、牛等動物的小腸黏膜下層、心包膜、真皮等組織通過脫細胞技術加工而成，保留了一定量的纖維、蛋白質、多糖等，更具備募集生長因子及組織修復相關細胞的潛力[11-12]，其中脫細胞豬心包膜(acellular porcine pericardium，APP)在臨床外科修復腹壁、疝、心瓣膜、硬腦膜等被證實具有良好的生物性能[13-14]。APP由Ⅰ型及Ⅲ型膠原構成，且富含彈性蛋白，使得其具備比純膠原膜更好的機械強度[13-16]；在與宿主組織作用過程中，炎癥反應較輕，同時可實現良好的再細胞化及再血管化[17]；有學者發現其體內降解速度更加匹配骨修復進程[18]。但對其相關性能的研究尚少見，本研究旨在評價一種新型脫細胞豬心包膜(博納膜?，北京博納格科技有限公司)的生物相容性，并探究其在犬拔牙窩實驗模型中作為屏障膜應用時對成骨效果的影響。

1 資料與方法

1.1 主要材料與試劑

脫細胞豬心包膜(博納膜?)由北京博納格科技有限公司惠贈，Bio-Gide?可吸收生物膜購自瑞士Geistlich公司，Bio-Oss?去蛋白牛骨基質骨替代材料購自瑞士Geistlich公司，α-MEM培養基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，青鏈霉素混懸液購自美國Sigma公司，0.25%(質量分數)胰蛋白酶購自美國Gibco公司，細胞增殖檢測(cell counting kit-8, CCK-8)試劑盒購自日本同仁公司，FITC標記鬼筆環肽和DAPI即用型染液購自北京索萊寶公司。

1.2 主要儀器與設備

場發射掃描電鏡購自德國Zeiss公司，細胞培養箱購自美國Thermo公司，酶標儀購自美國Biotek公司，激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司，Micro-CT購自美國Siemense公司，輪式組織切片機購自德國Microm公司，光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

A， coronal view of region of interest (ROI); B， saggital view of ROI; C， central vertical line (CVL). BC， buccal crest； LC， lingual crest； VD， vertical distance.圖1 ROI區域的選擇及頰舌側骨嵴頂高度的測量Figure 1 Choosing method of ROI and measurement of the vertical distance between the buccal and lingual(palatal) crest

A， smooth side of acellular porcine pericardium (APP)； B， rough side of APP； C， cross section of APP.圖2 APP微觀形貌(×300)Figure 2 Microstructure of APP (×300)

The left three rows were viewed at 250 magnification and the right three were at 5 000 magnification. Actins of cells were shown in green and nuclei were blue. APP， acellular porcine pericardium； BG， Bio-Gide.圖3 hBMSCs不同膜上的增殖及黏附形貌Figure 3 CLSM view of the morphology of hBMSCs cultured on BG or APP membranes

1.3 APP膜微觀形貌觀察

將APP膜裁剪為0.5 cm×0.5 cm大小，經金屬離子濺射儀對試樣進行噴金處理后，場發射掃描電鏡觀察其微觀結構。

1.4 APP膜體外生物相容性檢測

1.4.1骨髓間充質干細胞增殖實驗 將APP膜、Bio-Gide膜裁剪為5 mm直徑圓形試樣，置于96孔板，使用培養基預孵24 h。提取培養人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)，將P4代hBMSCs以5×103個/孔接種于膜上，在培養第1、3、7天依照CCK-8試劑盒說明書測定細胞增殖情況。每組3個復孔，實驗重復3次。

1.4.2骨髓間充質干細胞增殖形態觀察 接種方法同1.4.1小節，在培養至第5天時，4%(體積分數)多聚甲醛固定細胞15 min，0.5%(質量分數)Triton-X100透化10 min，5%(質量分數)BSA封閉1 h，加入1 ∶200(體積比)稀釋的鬼筆環肽工作液，室溫避光孵育30 min，PBS充分清洗后，加入DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)染液復染細胞核30 s，激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)觀察。

APP group after 4 weeks’ healing (A， ×40； D， ×200)， after 12 weeks’ healing (G， ×40； J， ×200)； BG group after 4 weeks’ healing (B， ×40； E， ×200)， after 12 weeks’ healing (H， ×40； K， ×200)； blank group after 4 weeks’ healing (C, ×40; F, ×200), after 12 weeks’ healing (I, ×40； L, ×200). Asterisk, graft particles； NB， new bone； OB， old bone； blue arrow， osteoblast grew into the graft particles； green arrow， osteoid； M， membrane.圖5 各組冠方愈合4周及12周情況觀察Figure 5 Histological observations of coronal part of extraction sockets after healing of 4 weeks or 12 weeks

1.5 犬牙槽嵴保存動物實驗

1.5.1實驗動物 選取3只雄性比格犬， 18～24月齡，12～14 kg(購自北京市昌揚西山養殖場，飼養于軍事醫學科學院)，入住至少7 d后開始實驗。動物全程飼以軟食。本實驗開始前已經北京大學生物醫學倫理委員審查批準(LA2018293)。

1.5.2實驗分組 拔除比格犬一側上下頜第一前磨牙及第二前磨牙遠中根(近中根完善根管治療)，作為術后12周組實驗位點，選取其中9個位點，隨機分入以下3組：(1)APP組：拔牙窩內植入Bio-Oss骨粉并覆蓋APP膜，嚴密縫合；(2)BG組：拔牙窩內植入Bio-Oss骨粉并覆蓋Bio-Gide膜，嚴密縫合；(3)空白組：自然愈合。8周后，拔除另一側上下頜第一前磨牙及第二前磨牙遠中根，選取其中9個位點，處理方法同1.5.1，作為術后4周組實驗位點。

1.5.3實驗方法 異氟烷吸入麻醉下，1%(質量分數)碘伏消毒動物口周，0.12%(質量分數)氯己定溶液消毒口內術區。使用渦輪手機水冷下沿第二前磨牙(P2)中央頰溝分冠達根分叉處，近中根開髓、根管治療、樹脂充填。使用牙齦分離器分離牙齦，微創拔除P1及P2遠中根。翻開頰舌(腭)側牙齦全厚瓣，將APP膜或BG膜修剪至合適大小，將膜一端插入舌(腭)側牙齦與骨板間，填充無菌生理鹽水適當潤濕后的骨粉至平齊牙槽嵴頂，將膜另一端蓋過拔牙窩插入頰側牙齦與骨板間，嚴密縫合。術后8周另一側進行相同手術。術后3 d予動物肌肉注射80萬單位青霉素鈉，每天進行口腔沖洗，飼軟食，定期復查傷口愈合情況。術后12周空氣栓塞法處死動物，截取上下頜骨P1、P2處標本，10%(體積分數)中性甲醛溶液固定24 h。

1.5.4Micro-CT檢測 將所獲取的標本進行Micro-CT掃描，掃描條件為電壓80 kV,電流500 μA，曝光時間1 000 ms。使用分析軟件Inveon Research Workplace 4.2在每個位點最中央選取感興趣區域(region of interest, ROI,圖1A、B),以經過近遠中骨嵴頂連線并垂直于拔牙窩軸線的平面為ROI上界，圈選以拔牙窩軸線為中軸的直徑為3 mm、高8 mm的圓柱形為ROI-1，圈選直徑4.5 mm、高3 mm的圓柱形為ROI-2，計算各組ROI內軟組織體積、新生骨體積、骨髓腔體積及剩余骨移植材料體積。同時，測量各位點頰舌(腭)側骨嵴頂高度差(圖1C),在拔牙窩冠狀面上，校正拔牙窩中線垂直于水平面，過頰舌(腭)側骨嵴頂做平行于水平面的直線，測量兩條線之間的距離。

A， alveolar socket after tooth extraction； B， blank group after healing， soft tissue grew in and vertical bone lost； C， APP group or BG group after healing， less soft tissue grew in and less vertical bone lost.圖6 ROI區域示意圖Figure 6 Schematic diagram of ROI area

1.5.5組織學觀察 CT掃描后將標本置于17%(質量分數)EDTA溶液中脫鈣6個月，石蠟包埋，切取5 μm切片，進行HE染色。

1.6 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件，計量資料以均數±標準差表示，CCK-8數據選用獨立樣本t檢驗，CT數據采用單因素方差分析，組間比較采用 LSD 法,P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 APP膜微觀形貌觀察

APP膜具有天然的雙面性，一面相對光滑(圖2A)，具有天然的微皺褶，一面相對粗糙(圖2B)，截面可見膠原束相互交錯，形成天然多孔等級結構，粗糙面側孔徑較小，中央孔徑最大，光滑面側孔徑居中，孔內可見纖維微絲(圖2C)。

2.2 APP膜體外生物相容性檢測

2.2.1骨髓間充質干細胞增殖實驗 CCK-8實驗顯示，接種后第1天，APP組的光密度值為0.193，BG組為0.177，差異無統計學意義(P>0.05)；接種后第3天，APP組光密度值增長至0.231，BG組為0.220，差異無統計學意義(P>0.05)；第7天，APP組進入倍增期，光密度值為0.529，顯著高于BG組(光密度值0.341，P<0.05)。

2.2.2骨髓間充質干細胞增殖形態觀察 接種5 d后hBMSCs在兩種膜上都呈現出較好的黏附狀態，可見舒展的細胞結構、沿膠原束延伸的細胞骨架，并可觀察到APP上的細胞增殖數量明顯多于BG膜(圖3)。

2.3 犬牙槽嵴保存動物實驗

實驗期間各組動物健康狀態良好，手術傷口愈合正常，未出現傷口開裂、感染、骨粉暴露等。

2.3.1Micro-CT結果 ROI-1表征拔牙窩整體愈合情況，術后4周(表1)，空白組新生骨比例略高于APP組及BG組，但差異無統計學意義(P>0.05)，空白組骨髓腔所占比例顯著低于APP組及BG組，冠方軟組織體積顯著高于APP組及BG組(P<0.05)，APP組及BG組各類組織分布比例相近，差異無統計學意義(P>0.05)。術后12周(表1)，APP組及BG組新生骨比例均明顯高于術后4周空白組(P<0.05)，組間差異無統計學意義，空白組新生骨比例低于術后4周，但結果差異無統計學意義(P>0.05)，APP組及BG組骨髓腔比例較術后4周明顯降低(P<0.05)，并顯著低于空白組(P<0.05)， 空白組骨髓腔比例較術后4周略有升高，結果差異無統計學意義(P>0.05)，APP組冠方軟組織比例較術后4周明顯減小(P<0.05)，BG組略有減小，差異無統計學意義(P>0.05)，兩組軟組織比例均顯著低于空白組，兩組剩余骨移植物比例隨時間無顯著變化(P>0.05)。ROI-2表征拔牙窩入口處(膜下方)愈合情況，分析發現(表2)，術后4周，APP組及BG組冠方新生骨比例、骨髓腔比例顯著高于空白組(P<0.05)，冠方軟組織比例顯著低于空白組(P<0.05)，組間各組織比例差異無統計學意義(P>0.05)。術后12周，APP組冠方新生骨比例顯著高于BG組(P<0.05)，兩組均較空白組顯著高(P<0.05)，各組比例均較對應術后4周組明顯上升(P<0.05)，APP組及BG組骨髓腔體積均較對應術后4周降低，其中，APP組差異有統計學意義(P<0.05)，空白組變化不明顯(P>0.05)。各組軟組織比例均較術后4周下降，APP組及BG組軟組織比例顯著低于空白組(P<0.05)。測量各組不同時間點頰舌側骨嵴頂高度差發現(表3)，術后4周及12周，APP組骨嵴頂高度差與BG組差異無統計學意義(P>0.05)，但顯著低于空白組(P<0.05)。各組術后12周骨嵴頂高度差均較4周增大，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 術后4周、12周各組ROI-1區域不同組織所占比例Table 1 Percentage of different areas in ROI-1 at 4 weeks and 12 weeks /%

表2 術后4周、12周各組ROI-2區域不同組織所占比例Table 2 Percentage of different areas in ROI-2 at 4 and 12 weeks /%

表3 術后4周、12周各組頰舌側骨嵴頂高度差Table 3 Vertical distance of buccal and lingual crest /mm

2.3.2組織學觀察 術后4周(圖4A～F)，各組均可見新生的未成熟編織骨結構，與舊骨界限清楚，新生骨小梁外周可見大量成骨細胞排列。APP組及BG組新骨主要由拔牙窩壁周圍向中央生長，中央可見大量未礦化纖維骨基質組織及骨粉之間不同程度礦化的骨島，一些骨粉顆粒內部可見成骨細胞長入,周圍可見類骨質沉積。空白組內部可見均勻的新生編織骨，連通性較差，個別骨小梁表面可見多核破骨細胞，可及部分纖維骨基質組織，中部及根方可見大量脂肪空泡組織及小血管。觀察冠方組織(圖5A～F)，APP組冠方可見部分膜殘留及孤立骨島，BG組膜幾乎降解完全，新骨局限在骨嵴頂周圍,兩組冠方均未見新骨封閉入口，但骨基質具有凸起、豐滿的形態。空白組冠方有較多編織骨形成，但豐滿度較差。術后12周(圖4G～L)，APP組膜降解完全，APP組及BG組新生骨較術后4周明顯成熟，與舊骨界限不清，新生骨外周成骨細胞較前減少，內部可見發育中的骨單位，中央仍可見不同程度礦化的骨島。APP組及BG組依然維持著較好的冠方組織豐滿度(圖5G～L)， APP組拔牙窩入口處觀察到更多的凸形排列的新生骨，表面仍有成骨細胞，與上方結締組織間有一層骨基質存在，BG組也可以見冠方部分成骨，少于APP組。空白組骨小梁改建吸收明顯，冠方形成較成熟的皮質骨，形態凹陷，表面凹凸不平，有較為成熟的骨膜樣組織形成。

3 討論

本研究發現APP膜具有天然的雙面性。天然心包膜由漿膜層、纖維層、脂肪層構成[19]，漿膜層表面排布單層間皮細胞，脫細胞處理后，細胞及脂肪層被去除，漿膜層呈現出光滑的微皺褶形貌，纖維層與脂肪層交界處呈現粗糙的表面形貌。同時，本研究還發現APP膜具有三維多孔等級結構，有利于營養物質的交換，并且，其孔徑相對較小的一側可發揮體內屏障作用，阻擋軟組織長入骨缺損，孔徑較大一側利于成骨相關細胞黏附及骨基質沉積，促進冠方成骨[20]。

本研究通過細胞增殖實驗證實，APP膜和BG膜均能夠促進人骨髓間充質干細胞在表面的增殖，APP膜在第7天表現出更強的促進能力，與Rothamel等[18]研究結論一致。另一項研究發現[21]，人牙齦成纖維細胞在APP膜上也實現了良好的增殖及黏附。目前，關于膜在GBR中的分子學及細胞學機制尚不明確。本研究發現APP膜冠方成骨稍好于BG膜，PP膜是常見的ECM材料之一，主要成分為Ⅰ型及Ⅲ型膠原，脫細胞后仍較好地保持原有ECM結構，天然的ECM結構可能會引起體內細胞的行為響應，促進其增殖、分化等。此外，心包膜在脫細胞后殘留的一定量糖胺聚糖、糖蛋白是介導細胞黏附、生長的重要因子[11,22]。既往多項研究發現了脫細胞心包膜在不同領域的再生潛質，Rajabi-Zeleti等[23]發現脫細胞心包膜可促進心肌祖細胞向心肌細胞分化；Megerle等[24]發現脫細胞心包膜可促進人腱鞘滑膜細胞及人脂肪干細胞分泌透明質酸，具備促進腱鞘滑膜再生的潛質；Pizzicannella 等[25]發現脫細胞心包膜可作為牙周膜干細胞及內皮細胞共培養的三維平臺，促進體外成骨成血管進程。本研究發現APP膜表面更利于骨髓間充質干細胞增殖，體內實驗可觀察到APP膜較BG膜更多的膜下方成骨及更低的頰側骨嵴頂改建程度。

本研究通過體內犬牙槽嵴保存動物實驗探究了APP膜作為GBR屏障膜的作用效果，實驗采用了Micro-CT和組織學評價的方法。APP組及BG組總體成骨效果差異無統計學意義，但通過對冠方組織的Micro-CT分析及組織學觀察可發現兩組冠方成骨的差異。術后4周，兩組膜下方成骨量差異無統計學意義，但組織學觀察發現，BG組冠方成骨多與骨嵴頂相連，而APP組冠方成骨除骨嵴頂長出外，可觀察到膜下方的孤立骨島；術后12周，APP組冠方成骨顯著多于BG組。

有關Micro-CT新生骨測量方法是研究者需要考慮的問題，本研究方法基于Saulacic等[26]的ROI區域測量方法改進而來，一方面，該方法可避免由于術后12周新舊骨界限不清，難以圈選整個牙槽窩范圍及圈選到舊骨造成結果偏高等問題；另一方面，由于牙槽窩壁周圍接觸成骨速度快于植骨材料周圍成骨，圈選中央部分分析更能客觀反映GBR的成骨情況；同時，牙槽窩近遠中骨嵴頂因附著于鄰牙，高度相對穩定，可作為參考線[26]，ROI區域內冠方測量的軟組織體積可作為衡量拔牙后牙槽嵴高度變化的參考，并輔助表征膜屏障效果。因此，本研究以經近遠中骨嵴頂連線且垂直于牙槽窩長軸的平面作為參考平面，在圈選牙槽窩中央圈選圓柱形ROI(圖6)。

本研究術后4周各組新生骨量差異無統計學意義，術后12周APP組及BG組新生骨量顯著多于空白組，組織學觀察到它們的編織骨小梁進一步礦化成更成熟的層板骨，冠方新生骨不連續，但形態飽滿、凸起，骨小梁周圍可觀察到較多成骨細胞排布及礦化中的骨基質，表明屏障膜在體內較好地維持了成骨空間，與Saulacic等[26]、Kim等[27]研究發現的牙槽嵴保存體內愈合過程相似。而空白組冠方形成了較為成熟的皮質骨，但表面可見凹凸不平的骨陷窩，在成熟過程中骨小梁數目明顯變少，牙槽窩內部主要為富含脂肪空泡的骨髓腔，有研究認為可能是軟組織的長入引入破骨細胞所致[4]。通過使用屏障膜，在阻擋軟組織長入的同時，也一定程度降低了破骨細胞對早期成骨過程的影響。

頰舌側骨高度差是既往研究中多用的衡量牙槽嵴保存效果的另一指標[27-29]。本研究發現空白組頰側骨嵴頂吸收多于APP組及BG組，表現出明顯的骨改建吸收，測量出的數據結果與既往研究結果較為一致[27-29]，其原因可能是在牙齒拔除后，束狀骨迅速改建，一方面表現為拔牙窩內大量編織骨形成，另一方面主要由束狀骨構成的頰側骨板在前4周內厚度明顯減小、高度明顯降低，而舌(腭)側骨板因還含有層板骨組成，在改建過程中骨嵴頂高度變化不顯著[30]。通過進行牙槽嵴保存，使骨移植物周圍及膜下方成骨在一定程度可以彌補束狀骨改建過程中造成的骨吸收，同時促進拔牙窩內形成更好的骨質[3,31]。

綜上所述，APP膜具有良好的三維結構及細胞相容性，在犬牙槽嵴保存動物實驗中，與Bio-Gide膜屏障效果相似。此外，本研究證實其與Bio-Gide膜相比可更好地促進膜下方成骨及減少頰側骨嵴頂吸收。據此可推測，APP膜不單在體內起到被動屏障的作用，還可能募集成骨相關細胞，促進其增殖分化，具有骨組織工程支架潛質。當然，關于APP膜確切的骨誘導潛質及在GBR中的細胞機制尚待進一步研究。

[志謝：感謝北京博納格科技公司為本實驗提供脫細胞心包膜(博納膜?)材料。]