載藥脂質(zhì)體修飾的聚醚醚酮植入物的抑菌和骨整合性能

王立新，許 曉，倪耀豐，孫海濤，余日月，魏世成

(1. 首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院口腔科， 北京 100038； 2. 北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院，口腔頜面外科 國家口腔醫(yī)學中心 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室， 北京 100081)

目前應(yīng)用較為廣泛的骨替代修復材料主要包括純鈦及鈦合金等醫(yī)用金屬材料和聚醚醚酮(polyetheretherketone，PEEK)等高分子材料，其中PEEK具有多種優(yōu)越的性能，尤其是其彈性模量與人體皮質(zhì)骨的彈性模量較接近，可以降低應(yīng)力屏蔽現(xiàn)象，避免可能的骨損傷[1-2]。但PEEK是生物惰性材料，在體內(nèi)不能發(fā)揮生物活性，進而影響了植入物-骨界面的骨整合。影響植入物-骨界面骨整合的因素很多，當前研究認為主要包括植入物表面的促成骨活性和感染[3-4]。因此，為了拓寬PEEK在骨科、口腔科等領(lǐng)域的臨床應(yīng)用前景，必須提高惰性PEEK的成骨活性，同時使其能預(yù)防細菌污染。既往文獻報道，最常用的方法是通過物理或化學方法制備生物活性涂層使PEEK功能化，許多涂層(包括羥基磷灰石、生物活性小分子、磷酸鈣、鈦等)在增強PEEK植入物的骨整合方面具有實用價值[5-7]，但這些方法仍然存在許多亟待解決的問題，包括化學步驟復雜耗時、涂層易降解、涂層與基底粘接不良等。

聚多巴胺(polydopamine，pDA)涂層是一種易于操作的表面改性方法。通過在弱堿性水環(huán)境中簡單浸泡方式，多巴胺幾乎可以在所有材料表面(無需預(yù)處理)形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的pDA薄膜，而且pDA的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)可以進一步連接含氨基或巰基的生物活性分子，進而實現(xiàn)材料表面的二次修飾，該方法已被廣泛用于各種生物材料的功能化[8-9]。但pDA不適合直接固定進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用的生物活性小分子，如米諾環(huán)素(minocycline，Mino；一種廣譜四環(huán)素類抗生素)和地塞米松(dexamethasone，Dex；一種具有促成骨作用的糖皮質(zhì)激素)[10-11]。目前，克服這一限制的策略主要是使用納米遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)體(liposome，lipo)，其可攜帶、運輸和緩慢釋放生物活性小分子到細胞質(zhì)中[12]。

結(jié)合以上研究背景，本研究提出PEEK表面功能化改性方案(圖1)：用脂質(zhì)體作為藥物運輸載體同時包載Dex和Mino，然后進一步利用多巴胺的自聚合及邁克爾加成反應(yīng)(Michael addition reaction)，將Dex/Mino脂質(zhì)體共價接枝在PEEK表面；先對功能化的PEEK進行熒光表征，再將其植入體內(nèi)，分別建立小鼠皮下植入感染模型和比格犬股骨植入模型，評價該表面修飾方法是否有效地提高了PEEK表面的抑菌和促成骨活性，為進一步將該材料用于臨床提供依據(jù)。

PEEK, polyetheretherketone; pDA, polydopamine; Dex, dexamethasone; Mino, minocycline； S. mutans, Streptococcus mutans.圖1 Dex/Mino脂質(zhì)體功能化修飾的PEEK表面的制備及其體內(nèi)骨整合性能(包括抑菌和促成骨活性)評價的示意圖Figure 1 Schematic illustration of the preparation of Dex/Mino liposome-decorated PEEK through pDA coating, as well as its bacteriostasis and osseointegration in vivo for load-bearing bone repairing

1 材料與方法

1.1 制備Dex/Mino脂質(zhì)體

Dex/Mino脂質(zhì)體按照薄膜分散法制備[13-14]。按照摩爾比例1.85 ∶1.00 ∶0.15 ∶0.25精密稱取相應(yīng)的二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基和Dex于茄形瓶中，按照 1 ∶1(體積比)加入甲醇和氯仿的混合溶劑并搖動使溶質(zhì)溶解；使用75 r/min的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在47 ℃恒溫水浴中減壓干燥徹底除去有機溶劑，瓶內(nèi)壁形成一層均勻的脂膜。取適量的水化液(120 mmol/L無水乙酸鈉和無水氯化鈣的混合液，pH=7.9)加入茄形瓶中，于47 ℃恒溫水浴中超聲水化，直至內(nèi)壁脂膜完全脫落形成懸液；迅速將所得脂質(zhì)體懸液依次通過孔徑為220 nm和100 nm的濾器擠出數(shù)次，即得到具有濃度梯度的Dex脂質(zhì)體，使用 0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉緩沖液過夜透析。透析后的 Dex 脂質(zhì)體與適量Mino儲液(藥脂比為1 ∶10)混合，50 ℃條件下振搖茄形瓶30 min使Mino載入脂質(zhì)體水相中，即得到Dex/Mino脂質(zhì)體，使用磷酸鹽緩沖液過夜透析后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 制備Dex/Mino脂質(zhì)體修飾的PEEK

將純PEEK片(直徑10 mm，長度1 mm)和純PEEK種植體(直徑4 mm，長度7 mm)依次放置于丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗各2 h，50 ℃干燥后待用。將多巴胺粉末加入pH=8.5 的Tris緩沖液(10 mmol/L)中混勻得到多巴胺溶液(2 g/L)，然后將純PEEK片/純PEEK種植體放入多巴胺溶液中，在37 ℃條件下反應(yīng)18 h，搖床設(shè)置為70 r/min，超聲清洗3次后將樣品命名為PEEK-pDA。37 ℃條件下將PEEK-pDA在Dex/Mino脂質(zhì)體懸液(1 g/L)中靜置浸泡24 h，輕輕清洗3次后將樣品命名為PEEK-Dex/Mino lipo。

1.3 熒光脂質(zhì)體修飾的PEEK表面的定性及定量檢測

本實驗在避光條件下完成。分別將純PEEK和PEEK-pDA片浸泡于1.0 g/L的熒光脂質(zhì)體溶液中24 h，輕輕清洗3次，得到的樣品命名為PEEK非功能化(non-functionalized，NF)脂質(zhì)體(PEEK-NF-lipo)和PEEK-pDA-lipo。使用激光共聚焦顯微鏡拍攝樣品表面脂質(zhì)體分布情況；加入甲醇400 μL溶解化學接枝的脂質(zhì)體(70 r/min，5 min)，取100 μL到96孔板中，使用酶標儀檢測PEEK表面脂質(zhì)體的熒光接枝密度。

1.4 小鼠皮下植入感染模型建立

1.4.1實驗動物 雄性C57BL/6小鼠(6～8周齡)，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，在無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究得到了北京大學動物倫理委員會的批準(批準號：LA2015149)。

1.4.2變形鏈球菌菌液準備 變形鏈球菌(UA159)由北京大學口腔醫(yī)院中心實驗室微生物平臺提供。培養(yǎng)方法：于-80 ℃冰箱取出甘油凍存菌，溶化后與Todd-Hewitt(TH)液體培養(yǎng)基混勻，使用螺旋接種儀將菌液復蘇于腦心浸液(brain heart infusion，BHI)固體培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)48 h，挑取一個單克隆于TH液體培養(yǎng)基(1 mL)中繼續(xù)培養(yǎng)24 h備用。

1.4.3手術(shù)植入及石蠟切片染色 實驗分兩組，每組兩只小鼠。將小鼠稱重，使用1%(質(zhì)量分數(shù))戊巴比妥鈉腹腔注射使其麻醉；將小鼠俯臥位固定，脫毛使皮膚充分暴露，常規(guī)消毒；使用組織剪剪開小鼠皮膚，鈍性分離形成皮下囊袋；使用加樣槍在兩組PEEK片表面分別接種10 μL變形鏈球菌(1×108CFU/mL)；將表面接種了細菌的PEEK片置于皮下，使用角針縫合皮膚；術(shù)后將小鼠放于37 ℃保溫臺上，觀察小鼠麻醉后蘇醒狀態(tài)。術(shù)后24 h，腹腔注射1%(質(zhì)量分數(shù))戊巴比妥鈉處死小鼠后取樣，組織塊于4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛中固定后流水沖洗，脫水透明，浸蠟并包埋形成蠟塊；使用石蠟切片機切片后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色。

1.5 比格犬股骨植入模型建立

1.5.1實驗動物 三只健康的雄性比格犬，1.5年齡，體質(zhì)量(11.2±0.6) kg，由北京瑪斯生物技術(shù)有限公司提供，在普通級環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究得到了北京大學動物倫理委員會的批準(批準號：LA2018226)。

1.5.2比格犬股骨內(nèi)種植體的植入 比格犬稱重，使用3%(質(zhì)量分數(shù))戊巴比妥鈉脛前靜脈注射使其全身麻醉。將比格犬側(cè)臥位固定于恒溫手術(shù)臺上，脫毛使皮膚充分暴露，常規(guī)消毒鋪巾；切開皮膚，切口處局部注射含腎上腺素的利多卡因，小心分離肌肉、血管，充分暴露股骨；使用高速渦輪機和直徑為4 mm的鉆針備洞，洞深達到7 mm，備洞過程中使用生理鹽水降溫；將樣本置于準備好的洞中，每個股骨隨機植入2～3個種植體，兩組分別植入8個種植體；依次用圓針和角針嚴密對位縫合肌肉和皮膚。術(shù)后及時觀察比格犬麻醉蘇醒狀態(tài)，連續(xù)3天肌肉注射10 U/kg青霉素鈉，留意觀察比格犬的傷口愈合情況，若出現(xiàn)紅腫或感染等癥狀則及時處理，第7天拆線。

1.5.3Micro-CT分析及硬組織切片染色 手術(shù)8周后，脛前靜脈注射3%(質(zhì)量分數(shù))戊巴比妥鈉處死，獲取股骨組織標本，將其放置于10%(質(zhì)量分數(shù))中性福爾馬林溶液中充分固定；利用Micro-CT掃描股骨樣本，使用Micro-CT分析軟件重建三維的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)。Micro-CT完成后，修剪樣本，流水清洗，使用梯度乙醇對樣本脫水，將股骨樣本先后浸泡于滲透液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中，然后置入包埋液中固定，使用硬組織修片機切割修整樣本，切片后進行HE染色。

1.6 統(tǒng)計學分析

使用Origin 8.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行分析處理；數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PEEK表面熒光脂質(zhì)體接枝定性及定量分析

本實驗使用熒光檢測來評價脂質(zhì)體是否共價修飾于PEEK表面，圖2為代表性的熒光圖像及其相對應(yīng)的脂質(zhì)體接枝強度定量。熒光標記的脂質(zhì)體同時附著于PEEK-NF-lipo和PEEK-pDA-lipo上，PEEK-pDA-lipo組的紅色熒光強度強于PEEK-NF-lipo組，并在其表面均勻分散。定量結(jié)果進一步證實，由于pDA涂層的存在，更多熒光標記的脂質(zhì)體被共價固定在PEEK表面，說明脂質(zhì)體成功修飾于PEEK表面并在其表面均勻分布。

2.2 小鼠皮下PEEK片植入后抑菌作用的評價

本實驗將Dex/Mino脂質(zhì)體修飾的PEEK(表面接種變形鏈球菌菌液)植入C57BL/6小鼠皮下，評估其體內(nèi)抗菌活性和組織學反應(yīng)。通過HE染色評估小鼠體內(nèi)組織學反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，兩組樣品周圍的皮下組織中都有炎性細胞(圖3)，但與純PEEK組相比，PEEK-Dex/Mino lipo組的炎性細胞數(shù)量較低，說明純PEEK組的感染嚴重程度高于功能化PEEK組，提示Dex/Mino脂質(zhì)體修飾的PEEK在體內(nèi)可有效地預(yù)防感染。

NF, non-functionalized; lipo, liposome. Other abbreviations as in Figure 1. *P<0.05.圖2 PEEK-NF-lipo組和PEEK-pDA-lipo組表面的熒光定性及定量分析(n=11)Figure 2 Qualitative and quantitative fluorescence analysis of PEEK-NF-lipo group and PEEK-pDA-lipo group (n=11)

2.3 比格犬股骨內(nèi)PEEK植入后骨整合能力的評價

本研究建立了一個比格犬股骨植入模型，將功能化PEEK植入股骨骨髓腔(圖4A、B)，評價改性PEEK表面的骨整合能力。術(shù)后8周采用Micro-CT技術(shù)來評估骨樣本，可見純PEEK周圍的新生骨是不連續(xù)的、間斷的(圖4C)，而Dex/Mino脂質(zhì)體修飾的PEEK周圍則形成更多連續(xù)的、致密的新骨(圖4D)；純PEEK組的新生骨容積比例(骨體積/總體積，bone volume/total volume，BV/TV)為 0.09，PEEK-Dex/Mino lipo組的BV/TV值為0.27。上述結(jié)果表明，與純PEEK相比，Dex/Mino脂質(zhì)體修飾的PEEK顯著促進了新骨形成。HE染色結(jié)果顯示，純PEEK界面有新骨碎片，且與新骨組織的間隙較大；PEEK-Dex/Mino lipo組新骨形成比純PEEK組多，且牢固地結(jié)合在功能化修飾的PEEK表面，沿著PEEK界面延伸(圖5)，與Micro-CT結(jié)果一致。以上結(jié)果提示，Dex/Mino脂質(zhì)體的修飾加速了骨沉積，促進了骨融合，Dex/Mino脂質(zhì)體修飾的PEEK能更好地與宿主骨結(jié)合，促進新骨形成。

3 討論

由感染、創(chuàng)傷、炎癥、骨腫瘤等原因?qū)е碌墓侨睋p通常需要使用骨替代修復材料進行手術(shù)植入修復[15-18]。決定骨替代修復材料植入成功與否的關(guān)鍵是植入物-骨界面的骨整合，材料的表面性質(zhì)決定了植入物與體內(nèi)周圍組織整合的最終能力[19-20]。為了實現(xiàn)植入后的最佳骨整合，在不破壞PEEK眾多優(yōu)點的前提下，采用表面改性方法增強PEEK表面的生物活性是首選途徑[1]。本研究以pDA涂層作中間介質(zhì)，將Dex/Mino脂質(zhì)體修飾到PEEK表面，使其表面功能化，熒光脂質(zhì)體接枝定性及定量檢測提示脂質(zhì)體已成功共價修飾在該表面，而且在該表面均勻分布。

由于植入物表面與周圍組織的界面易受細菌侵襲，如果感染得不到控制，可能會導致術(shù)后植入失敗，因此植入物表面的抑菌作用至關(guān)重要[21]。細菌在植入物界面上的初始粘附是感染的一個關(guān)鍵因素，也是生物膜形成的一個關(guān)鍵步驟，考慮到植入物的持久使用，在術(shù)后植入初期阻斷細菌對植入生物材料的粘附至關(guān)重要[22-23]。本研究通過建立小鼠皮下植入感染模型，評估功能化PEEK在體內(nèi)的抑菌活性及組織學反應(yīng)。HE染色結(jié)果顯示，與純PEEK組相比，PEEK-Dex/Mino lipo組的炎性細胞浸潤程度較輕，即感染程度較輕，說明Dex/Mino脂質(zhì)體修飾提高了惰性PEEK的抗感染活性，Mino的釋放在體內(nèi)更有效地預(yù)防了感染發(fā)生。

骨整合會指引成骨細胞在植入物表面定植，合成細胞外骨基質(zhì)，最終形成新骨[24-25]。研究體內(nèi)組織細胞對Dex/Mino脂質(zhì)體修飾的PEEK的反應(yīng)是骨整合的重要指標之一，同時與本研究的PEEK材料是否能夠成為生物醫(yī)學植入物密切相關(guān)。本研究通過建立比格犬股骨植入模型，評估功能化PEEK的體內(nèi)新骨生成及骨整合能力。Micro-CT及組織學分析結(jié)果顯示，與純PEEK組相比，PEEK-Dex/Mino lipo組促進更多新骨生成，而且功能化PEEK與新生骨牢固結(jié)合。既往研究指出，Dex修飾的納米顆粒或納米纖維可促進體外成骨相關(guān)蛋白表達及體內(nèi)鈣化骨形成[26-27]，提示Dex/Mino脂質(zhì)體涂層修飾PEEK后，脂質(zhì)體中Dex的釋放必然促進骨髓腔中成骨細胞的生長及新骨再生。經(jīng)Dex/Mino脂質(zhì)體修飾后，Dex的釋放在體內(nèi)更有效地刺激和引導了新骨再生。生物惰性PEEK周圍的新骨形成增加，進一步促進了PEEK與骨之間的骨化，提示Dex/Mino脂質(zhì)體修飾的PEEK更有利于提高體內(nèi)骨整合。

A, HE staining of mouse after subcutaneous implantation for 24 h; B, quantification of inflammatory cells in Figure A (×20). Abbreviations as in Figure 1 and 2. *P<0.05.圖3 小鼠皮下植入24 h后的組織切片HE染色及炎性細胞定量(n=5)Figure 3 HE staining and inflammatory cell quantification of mouse after subcutaneous implantation for 24 h (n=5)

A, a PEEK implant; B, macroscopic image of a beagle’s femur containing implants; C, micro-CT 3D reconstruction images of PEEK; D, micro-CT 3D reconstruction images of PEEK-Dex/Mino lipo.圖4 功能化PEEK植入比格犬股骨8周后的Micro-CT分析Figure 4 Micro-CT analysis of functionalized PEEK after 8 weeks of Beagle’s femur implantation

Abbreviations as in Figure 1 and 2.圖5 功能化PEEK植入比格犬股骨8周后的橫向示意圖及HE染色分析Figure 5 Schematic illustration of the transverse perspective and HE staining analysis of functionalized PEEK after 8 weeks of Beagle’s femur implantation

綜上所述，Dex/Mino脂質(zhì)體修飾的PEEK在體內(nèi)具有有效的抑菌和促進新骨再生的能力，作為牙科和骨科替代修復材料具有很大的臨床應(yīng)用潛力。