局部注射環孢素A對非肥胖糖尿病小鼠下頜下腺分泌功能及炎癥的影響

朱憶穎，閔賽南，俞光巖

(北京大學口腔醫學院·口腔醫院，口腔頜面外科 國家口腔醫學中心 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室 口腔數字醫學北京市重點實驗室, 北京 100081)

舍格倫綜合征(Sj?gren’s syndrome, SS)是一種全身慢性自身免疫性疾病，累及唾液腺后出現唾液分泌減少，導致口干及咀嚼、吞咽、語言等功能障礙，進而繼發猖獗齲、口腔黏膜真菌感染等，嚴重影響患者生活質量。目前SS多采用人工唾液進行對癥治療，采用毛果蕓香堿和西維美林等催唾劑促進唾液分泌[1]，病情較重者可采用免疫抑制劑[2]。整體而言，重癥SS尚缺乏成熟、有效的治療方法，仍是醫學界的一個難題。

非肥胖糖尿病(non-obese diabetic, NOD)小鼠是研究SS的經典動物模型[3]。NOD小鼠隨著年齡增長自發出現SS樣疾病表現，12～16周發生唾液腺淋巴細胞浸潤，唾液分泌功能降低，炎癥進一步加重[4]。

環孢素A(cyclosporine A, CsA)是20世紀70年代發現的免疫抑制劑，因其強大的免疫抑制作用，最先應用于器官移植后的免疫排斥[5]，也用于自身免疫性疾病[6]。

* P<0.05, # P<0.01, vs. control group; 14 weeks (n=7), 21 weeks (n=6).圖1 NOD小鼠刺激性唾液流率變化Figure 1 Variation in the stimulated saliva flow rate of NOD mice

A, HE staining of 14 weeks NOD mice; B, HE staining of 21 weeks NOD mice; C, FS of submandibular glands; D, the ratio index representing the ratio of the lymphocytic foci area to the total area of glandular tissue. Control, the control group; Low, the low dose group; High, the high dose group; FS, focus score. 14 weeks (n = 7), 21 weeks (n = 6), *P<0.05, # P<0.01, vs. control group.圖2 14周齡和21周齡NOD小鼠下頜下腺組織病理學改變Figure 2 Histopathological changes of the submandibular glands of 14 weeks and 21 weeks NOD mice

A, TUNEL and DAPI staining of 14 weeks NOD mice; B, TUNEL and DAPI staining of 21 weeks NOD mice; C, percentage of apoptotic cells. TUNEL, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling; DAPI, 4’, 6-diamidino-2-phenylindole. Control, the control group; Low, the low dose group; High, the high dose group. 14 weeks (n = 7), 21 weeks (n = 6), P > 0.05 vs. control group.圖3 14周齡和21周齡NOD小鼠下頜下腺細胞凋亡情況Figure 3 Cell apoptosis in the submandibular gland of 14 weeks and 21 weeks NOD mice

A, 14 weeks (n = 7); B, 21 weeks (n = 6); * P < 0.05, # P < 0.01, vs. control group. TNF-α, tumor necrosis factor α; IFN-γ, interferon γ; IL-4, interleukin 4; IL-13, interleukin 13; IL-17F interleukin 17F; IL-22 interleukin 22; IL-23a, interleukin 23a.圖4 14周齡和21周齡NOD小鼠下頜下腺炎癥細胞因子表達水平Figure 4 Levels of cytokines in the submandibular gland of 14 weeks and 21 weeks NOD mice

眼干是SS的主要癥狀之一，眼科在治療SS所致中至重度眼干時，常采用局部應用CsA滴眼液，緩解眼干癥狀[7]。局部用藥方法簡便，副反應小。唾液腺位置表淺，導管與口腔相連，可以采取經導管給藥的方式[8]，因此，唾液腺局部應用CsA對SS的治療作用是很值得研究的課題。

本研究擬以NOD小鼠為研究對象，探討局部應用CsA對下頜下腺分泌功能及炎癥的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

雌性NOD小鼠購于北京大學醫學部實驗動物科學部，SPF級環境飼養。所有實驗操作符合動物實驗倫理規范，本研究獲得北京大學生物醫學倫理委員會實驗動物福利倫理分會批準(LA2019215)。

1.2 實驗試劑

CsA購自北京索萊寶科技有限公司，Trizol試劑購自美國Thermo Scientific公司，5×All-In-One RT Master Mix逆轉錄試劑盒購自加拿大Applied Biological Materials公司，2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒購自美國Bimake公司，In Situ Cell Death Detection Kit購自羅氏診斷產品(上海)有限公司。

1.3 NOD小鼠分組及下頜下腺局部注射CsA

雌性NOD小鼠14周齡21只，21周齡18只，各周齡小鼠隨機均分為3組：(1)對照組：下頜下腺注射生理鹽水50 μL；(2)低劑量組：下頜下腺注射0.05%(質量分數) CsA 50 μL；(3)高劑量組：下頜下腺注射0.1%(質量分數) CsA 50 μL。術前小鼠禁食6 h[9]，自由飲水，稱重，選取空腹血糖水平 ≤ 11 mmoL/L的小鼠[10]。腹腔注射戊巴比妥(80 mg/kg體質量)麻醉，切開頸部皮膚，暴露雙側下頜下腺，使用50 μL微量進樣器進行多點注射。術后生理鹽水沖洗，6-0可吸收縫合線縫合傷口。1周后采集實驗樣品。

1.4 刺激性唾液流率的測定，樣本的采集及保存

小鼠麻醉方式同第1.3小節，腹腔注射M受體激動劑毛果云香堿(0.05 mg/100 g體質量)， 5 min后收集唾液，收集時間10 min，稱量離心管，以1 μg=1 μL換算為體積，計算刺激性唾液流率[μL / (min·100g體質量) ]。

經眼眶采血置于離心管，靜置,離心后吸取血清，-80 ℃保存。用第1.3小節方法暴露下頜下腺，顯微鑷剝離小鼠下頜下腺，一側下頜下腺使用4%(質量分數)多聚甲醛固定，另一側腺體置于離心管-80 ℃保存。

1.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining， HE)染色切片觀察NOD小鼠下頜下腺炎癥浸潤灶

用4%多聚甲醛固定下頜下腺24 h，常規脫水，石蠟包埋，連續切片(切片厚度5 μm)，HE染色。光學顯微鏡下觀察HE切片，局部 ≥ 50個淋巴細胞為一個浸潤灶。用徠卡圖像分析系統計數淋巴細胞浸潤灶的數量，并計算灶性指數(focus score, FS, 淋巴細胞浸潤灶個數/4 mm2)和淋巴細胞浸潤灶的面積比(淋巴細胞浸潤灶面積/該切片腺體組織面積)。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測下頜下腺炎癥細胞因子的表達

研磨下頜下腺組織，用Trizol試劑提取RNA，使用5×All-In-One RT Master Mix預混液逆轉錄為cDNA，2×SYBR Green qPCR Master Mix預混液進行qRT-PCR，檢測下頜下腺中炎癥細胞因子的mRNA表達。每一樣本做3個平行復孔，數據分析用 2-ΔΔCt法，GAPDH作為內參照，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.7 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法檢測NOD小鼠下頜下腺細胞凋亡

對下頜下腺石蠟切片脫蠟，滴加蛋白酶K，用磷酸鹽緩沖液洗滌。用破膜劑常溫孵育，按切片數量和組織大小取Tunel試劑盒內適量酶溶液和標記溶液混合，滴加至組織。PBS洗滌后滴加4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液，用抗熒光淬滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。選取5個高倍鏡視野進行計數，計算凋亡細胞陽性比例[11]。

1.8 小鼠血清肝腎功能分析

用全自動生化分析儀檢測血清，檢測指標為血清肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、尿酸(uric acid, UA)、丙 氨 酸 氨 基 轉 移 酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、白蛋白(albumin, ALB)和γ-谷氨酰基轉移酶(γ-glutamyl transferase，GGT)。

1.9 統計學分析

數據均采用均數±標準誤表示，采用Kruskal-Wallis檢驗、Dunnett’s T3檢驗、One-way ANOVA以及Bonferroni’s檢驗。統計學處理及作圖均通過GraphPad Prism 8.0軟件完成，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 刺激性唾液流率的檢測

在實驗終點收集刺激性唾液，計算刺激性唾液流率，評價唾液腺分泌功能，結果顯示21周齡對照組NOD小鼠刺激性唾液流率較14周齡對照組NOD小鼠減少，提示隨著唾液腺炎癥的進程，小鼠唾液腺分泌功能受損加重。局部注射CsA 1周后，14周齡NOD小鼠低劑量組和高劑量組刺激性唾液流率均較同齡對照組明顯增加(P<0.01或P<0.05)， 即使是21周齡的晚期SS小鼠，低劑量組和高劑量組刺激性唾液流率均較同齡對照組明顯增加(P<0.05，圖1)， 表明NOD小鼠下頜下腺局部注射CsA后唾液分泌量有所增加。

2.2 下頜下腺的組織病理學改變

顯微鏡下觀察NOD小鼠下頜下腺HE染色切片，14周齡和21周齡的對照組NOD小鼠，下頜下腺腺小葉結構存在，小葉內出現程度不等的淋巴細胞浸潤，形成數量不等的典型的淋巴細胞浸潤灶，腺泡減少，導管增生，未見明顯纖維組織形成(圖2A、B)。14周齡和21周齡小鼠低劑量組和高劑量組與對照組相比淋巴細胞浸潤程度減輕。對NOD小鼠淋巴細胞浸潤灶進行定量分析，一個指標是灶性指數(淋巴細胞浸潤灶個數/4 mm2，圖2C)，14周齡NOD小鼠低劑量組、高劑量組和對照組相比灶性指數顯著減少(分別為P<0.01和P<0.05)。21周齡NOD小鼠低劑量組和高劑量組的灶性指數低于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)。另一個指標是淋巴細胞浸潤灶面積比(圖2D)，14周齡 NOD小鼠低劑量組及高劑量組的平均面積比均明顯低于對照組(分別為P<0.01和P<0.05)。21周齡NOD小鼠低劑量組和高劑量組的灶性指數低于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 下頜下腺細胞的凋亡

用TUNEL法檢測NOD小鼠下頜下腺中細胞的凋亡，在腺體組織和淋巴細胞浸潤灶中均可觀察到凋亡細胞(圖3)， 21周齡NOD小鼠凋亡細胞多于14周齡小鼠組。14周齡和21周齡 NOD小鼠對照組的凋亡細胞數多于低劑量組和高劑量組，但凋亡細胞的百分比差異沒有統計學意義(P>0.05)。

2.4 下頜下腺炎癥細胞因子表達的改變

為探討CsA減輕下頜下腺炎癥反應的機制，用qRT-PCR方法檢測下頜下腺中炎癥細胞因子的表達水平，結果顯示，14 周 齡NOD小鼠下頜下腺局部注射CsA后，低劑量組腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4, IL-4)、IL-13、IL-17F表達水平較對照組差異無統計學意義(P>0.05)，IL-22、IL-23a表達水平較對照組顯著升高，分別為P<0.05和P<0.01。高劑量組TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-17F、IL-22、IL-23a表達水平均低于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05，圖4A)。21周齡 NOD小鼠下頜下腺局部注射CsA后，低劑量組和高劑量組較對照組TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-23a表達水平差異無統計學意義(P> 0.05),高劑量組IL-13、IL-17F、IL-22表達水平較對照組顯著升高(P<0.01，圖4B)。

2.5 下頜下腺局部注射CsA的安全性

CsA最主要的副作用是腎毒性，其次是肝毒性。本研究檢測了14周齡和21周齡小鼠與肝腎功能相關的血清UA、BUN、Scr、ALT、AST、GGT、ALP、ALB的變化。因目前NOD小鼠無大量統計學數據確定的肝腎功能正常參考值，本研究中以對照組為參考，分別比較低劑量組和高劑量組與對照組之間各項指標的差異，結果顯示各項檢測指標差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 NOD小鼠肝腎功能Table 2 NOD mice liver and renal function

3 討論

口干是SS的重要主訴，目前SS重度口干缺乏成熟有效的治療方法。基于CsA滴眼液在SS中重度眼干患者中的有效應用[7]，本研究試圖探討下頜下腺局部用CsA對SS唾液腺的影響。

NOD小鼠是常用的SS動物模型，下頜下腺7～8周時即可出現少量淋巴細胞浸潤，稱為初始期；12～16周炎癥細胞浸潤較為明顯，相當于SS發病前期；20～24周炎癥進一步加重，相當于發病后期[3-4]。為此，本研究選擇14周齡和21周齡NOD小鼠分別代表SS的發病前期和后期。

本研究結果顯示，對照組NOD小鼠14周齡時刺激性唾液流率降低，21周齡時進一步下降，表明隨著病期的延長，NOD小鼠的唾液分泌功能進一步下降，而下頜下腺局部注射CsA后的NOD小鼠，無論是低劑量組還是高劑量組，14周齡和21周齡的刺激性唾液流率均較對照組明顯增加，表明NOD小鼠下頜下腺局部注射CsA后唾液分泌功能有所改善，局部用CsA可能對SS導致的口干具有緩解作用。

SS的組織病理學特征是大量淋巴細胞浸潤，腺泡細胞減少，腺實質萎縮。2016年美國風濕病學會和歐洲抗風濕病聯盟發布了《2016 美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯盟原發性干燥綜合征分類標準》，其中一條為活檢病理淋巴細胞浸潤灶性指數≥1[12]。淋巴細胞浸潤程度通常認為與唾液腺功能障礙密切相關[13]。本研究NOD小鼠下頜下腺的組織病理學觀察結果顯示，下頜下腺局部注射CsA后，14周齡NOD小鼠低、高劑量組的平均淋巴細胞浸潤灶性指數及浸潤灶面積與對照組相比明顯下降或縮小；21周齡NOD小鼠低、高劑量組和對照組的差異沒有統計學意義，但仍可見其下降或縮小的趨勢，這可能是NOD小鼠下頜下腺局部注射CsA后唾液分泌功能得以改善的病理學基礎。唾液腺上皮細胞凋亡明顯增加是SS的病理學特征，也可能是SS唾液腺功能下降的重要原因之一。本研究結果顯示，對照組NOD小鼠14周齡時凋亡細胞明顯增多，21周齡時進一步增多。下頜下腺局部注射CsA后，14周齡和21周齡 NOD小鼠的凋亡細胞數有所減少，但差異沒有統計學意義。

促炎細胞因子的表達水平一定程度上反映了炎癥反應的活動度[14]。研究發現,NOD小鼠下頜下腺中淋巴細胞浸潤的增加通常伴隨著細胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ和TNF-α的mRNA表達增加[15]。T細胞、B細胞均對下頜下腺的炎癥發展有重要作用，淋巴細胞浸潤灶處可見到樹狀細胞和巨噬細胞，SS患者中也有相似的情況[16]。本研究對多種炎癥細胞因子進行了檢測，其中TNF-α、IFN-γ是Th1細胞因子，IL-4、IL-13是Th2細胞因子，IL-17F、IL-22是Th17細胞因子[17]，IL-23a是由樹狀或巨噬細胞分泌的細胞因子[18]，結果顯示高劑量組14周齡IL-13、IL-17F、IL-22、IL-23a的表達水平較對照組有下降趨勢，但21周齡 IL-13、IL-17F、IL-22表達仍有明顯上升。局部注射CsA對下頜下腺中炎癥細胞因子以及相關蛋白的影響尚需進一步研究。

CsA是較為傳統的免疫抑制劑，具有明確的免疫調節作用，廣泛應用于器官移植后免疫排斥的預防，也應用于自身免疫病的治療[17]。CsA代謝中間產物對腎臟負擔較大，同時CsA也會經肝臟分解，因此，其毒副反應主要是肝腎毒性[18]。為此，本研究檢測了CsA下頜下腺局部應用后的肝腎功能，包括腎功三項(UA、BUN、Scr)和肝功五項(ALT、AST、ALP、ALB、GGT)， 以對照組作為參考，結果顯示，低劑量組和高劑量組的NOD小鼠，其肝腎功能的檢測數據與對照組之間差異無統計學意義，表明在這個劑量范圍內用藥是安全的。

關于CsA局部用藥藥物濃度的選擇，美國食品藥品監督管理局指出，對于臨床試驗初始最大安全劑量，局部應用的藥物應以濃度為準，不需根據體質量或體表面積計算[19]。參照CsA滴眼液的眼科用藥[7, 20-21]，我們把CsA的藥物濃度設定為0.05%和0.1%兩組，比較兩組之間作用及安全性的差異，結果顯示，濃度為0.05%的低劑量組與未經治療的對照組相比，NOD小鼠唾液流率增加、下頜下腺組織中平均淋巴細胞浸潤灶性指數及浸潤灶面積比減小，均顯示明顯的治療效果。相對高劑量組(0.1%)， 上述指標與未經治療的對照組相比有明顯改善，與低劑量組相比沒有進一步提高，但肝腎功能在正常范圍，說明并沒有因劑量提高而增加毒性反應。基于在作用有效的前提下低劑量組首選的原則，在進一步研究或臨床應用中0.05%是推薦濃度。

綜上，CsA下頜下腺局部注射用藥可以降低NOD小鼠下頜下腺組織平均淋巴細胞浸潤灶性指數和浸潤灶面積比，減輕炎癥反應，提高NOD小鼠的刺激性唾液流率，改善唾液分泌功能。采用濃度為0.05%和0.1%的CsA下頜下腺局部注射，NOD小鼠的肝腎功能無異常，安全性良好。兩組均有改善唾液分泌功能的作用，0.05%可以作為推薦藥物濃度。