鈣結合蛋白在健康牙周組織和實驗性牙周炎組織的表達分布

郜洪宇，孟煥新，侯建霞，黃寶鑫，李 瑋

(1.北京大學口腔醫學院·口腔醫院，牙周科 國家口腔醫學中心 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室，北京 100081； 2.天津醫科大學口腔醫院牙周科，天津 300070)

牙周炎是發生在牙周組織的慢性感染性疾病，是成人牙喪失的主要原因，且嚴重危害全身健康[1]。近年來有關牙周炎發病機制的研究表明，宿主對致病菌感染過度的免疫炎癥反應是造成牙周組織破壞的主要原因[2-3]。中性粒細胞是先天免疫系統的重要細胞，位居宿主對牙周致病菌的第一道防線。當牙周感染發生時，大量的中性粒細胞率先到達感染部位，釋放多種生物活性酶及蛋白質，發揮抗菌功能，然而它們一旦過多地釋放，就會對周圍組織和細胞造成破壞，加重炎癥反應[4]。牙齦上皮在控制微生物感染、保護皮下組織和維持牙周組織穩態方面具有非常重要的作用，不僅發揮抗微生物的物理屏障作用，而且通過表達多種模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)識別病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)分泌多種細胞因子、趨化因子和抗菌肽，與病原微生物反應，在宿主免疫識別和啟動方面發揮著主動的生物屏障作用，參與宿主的先天性免疫反應和獲得性免疫反應[3,5]。

鈣結合蛋白(S100A8/A9)由S100A8和S100A9組成，是中性粒細胞的主要胞漿蛋白，在牙齦上皮細胞、活化的單核巨噬細胞和血管內皮細胞也有表達或誘導表達[6]。大量流行病學證據表明，鈣結合蛋白與牙周炎癥程度、牙周治療效果密切相關[7-10]。本課題組既往通過病例-對照研究、家系研究雙向證實S100A8基因多態性與侵襲性牙周炎易感性相關[11-12]；同時，發現侵襲性牙周炎患者血漿中鈣結合蛋白的水平顯著高于牙周健康者，鈣結合蛋白不僅與牙周臨床參數呈正相關關系，而且與血液白細胞數目、中性粒細胞數和百分比、C 反應蛋白水平也呈顯著正相關關系[13]，而齦溝液鈣結合蛋白濃度是血漿濃度的1 000倍以上，其主要來源可能是局部浸潤的中性粒細胞[14]。

要認識鈣結合蛋白在牙周炎發生發展中的作用，首先必須明確在牙周健康和牙周炎癥狀態下，鈣結合蛋白在牙周組織局部的表達分布、細胞定位和表達水平。但目前尚未見在牙周健康和炎癥狀態下，鈣結合蛋白在牙周組織中表達的直接證據。早期的學者對鈣結合蛋白在健康及炎癥時牙周組織中的表達進行過研究，但所研究的組織結構不完整[15-16]。因此，本研究旨在對鈣結合蛋白(S100A8/A9)在比格犬健康牙周組織、實驗性牙周炎組織內的表達分布情況進行系統觀察，明確其細胞定位,分析S100A8/A9的表達水平與炎癥的關系,探討S100A8/A9在牙周炎發生發展中可能發揮的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 牙周炎模型建立及組織標本處理

6只健康雄性純種比格犬(北京瑪斯生物技術有限公司提供)體質量10.0～12.5 kg，1～2歲齡。經全口齦上潔治后，隨機選擇一側下頜第二磨牙用棉線結扎誘導牙周炎，另一側用牙刷和0.12%(質量分數)氯己定溶液進行口腔衛生維護，每兩天一次。比格犬于誘導第6周、第12周在全麻下使用UNC 15 mm牙周探針檢測每顆牙近中、遠中兩個位點的探診深度(probing depth，PD)， 拍攝X線片確認牙槽骨存在吸收。誘導第12周，解剖頸總動脈、頸靜脈，過量麻醉藥處死后，用4%(體積分數)多聚甲醛溶液(pH=7.4)行頸總動脈灌注固定20 min。解剖下頜骨并將組織放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h。隨后進行10%(質量分數)乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)脫鈣，沖洗、脫水、透明、浸蠟后包埋、連續5 μm切片、展片、烤片、備用。本研究動物實驗開始前已經北京大學生物醫學倫理委員會實驗動物福利倫理分會審查批準(批準號：LA2010-032)。

1.2 免疫組織化學染色

組織切片經二甲苯、梯度乙醇溶液脫蠟至水，3%(質量分數)過氧化氫溶液室溫下處理標本20 min， 0.17%(質量分數)胰蛋白酶溶液37 ℃消化20 min，切片表面滴加鼠抗狗/人S100A8+S100A9(Abcam，英國)一抗工作液，用與一抗相同濃度的小鼠正常非免疫血清代替一抗作為陰性對照，置于濕盒，4 ℃過夜；二抗采用PV-9002小鼠超敏兩步法免疫組織化學試劑(中杉金橋，北京)，二氨基聯苯胺(diaminodiphenyl, DAB)顯色1～3 min，蘇木素復染，梯度乙醇溶液(酒精)脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。采用BX51-DP72顯微數字成像系統(Olympus，日本)拍照。

1.3 細胞培養

將北京大學口腔醫院綜合二科因正畸治療需要新鮮拔除的無牙體牙髓根尖病變且無牙周疾病的牙體完整的前磨牙或第三磨牙，放入無菌取樣管用于培養人原代牙周膜細胞(periodontal ligament cells，PDLCs)，同時將北京大學口腔醫院牙周科門診牙周手術切除的臨床健康的人牙齦組織(牙齦色粉、質韌，齦緣菲薄緊貼牙面，探診不出血)放入無菌取樣管，用于培養人原代牙齦成纖維細胞(gingival fibroblasts，GFs)。本研究細胞培養開始前已經北京大學口腔醫院倫理委員會審查批準(PKUSSIRB-2011007)。

1.4 免疫細胞化學染色

將4～8代的PDLCs、GFs以適宜密度接種至鋪有無菌蓋玻片的24孔板，5% (體積分數)CO2、飽和濕度的37 ℃培養箱中繼續培養。細胞過夜貼壁后，去除培養基，以4%多聚甲醛常溫固定20～30 min； 0.1% (質量分數)Triton X-100室溫10 min，3%(質量分數)過氧化氫溶液室溫下處理20 min。采用鼠抗狗/人S100A8+S100A9(Abcam，英國)一抗工作液，用與一抗相同濃度的小鼠正常非免疫血清代替一抗作為陰性對照，4 ℃過夜。二抗采用PV-9002小鼠超敏兩步法免疫組織化學試劑(中杉金橋，北京)， DAB顯色1～3 min，蘇木素復染，梯度乙醇溶液脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。采用BX51-DP72顯微數字成像系統(Olympus，日本)拍照。

2 結果

2.1 S100A8/A9在比格犬健康及牙周炎牙齦組織中的表達(圖1)

根據課題組前期發表的研究所描述[17]，實驗第12周時，結扎側的臨床表現、根尖片、HE染色結果均顯示比格犬實驗性牙周炎模型誘導成功。

在比格犬相對健康牙周組織中(圖1A)，牙齦組織完整，包括表面上皮、溝內上皮、結合上皮和上皮下結締組織，標本相對健康，僅有少量炎癥細胞浸潤。S100A8/A9主要表達于牙齦上皮和少量浸潤的中性粒細胞。在牙齦上皮內，S100A8/A9均在結合上皮處表達最強(圖1A3)，其次是表面上皮(圖1A1)，在溝內上皮表達最弱(圖1A2)。S100A8/A9的表達水平在結合上皮與溝內上皮的交界處差異明顯。

A， the expressions of S100A8/A9 in relatively healthy gingiva (lower magnification); B， the expressions of S100A8/A9 in periodontitis gingiva (lower magnification); A1， the magnified A1 boxed area of A; A2， the magnified A2 boxed area of A; A3， the magnified A3 boxed area of A; A4， the magnified A4 boxed area of A; B1， the magnified B1 boxed area of B; B2, the magnified B2 boxed area of B; B3, the magnified B3 boxed area of B; B4, the magnified B4 boxed area of B, arrows show fibroblast-like cells expressing S100A8/A9; D, dentin; CT, connective tissue.圖1 S100A8/A9在健康及實驗性牙周炎牙齦組織中的表達分布Figure 1 The expression and distrubution of S100A8/A9 in gingival tissues of periodontal health and experimental periodontitis

在實驗性牙周炎牙周組織的表面上皮中，上皮釘突增生，下方可見大量炎癥細胞浸潤，S100A8/A9在實驗性牙周炎組的染色強度(圖1B1)與健康牙周組織(圖1A1)類似；實驗性牙周炎牙周組織的溝內上皮糜爛潰瘍，上皮細胞間可見大量浸潤的炎癥細胞，上皮細胞向結締組織內增生呈條索狀或網眼狀，S100A8/A9呈強陽性表達(圖1B2)，其染色強度與健康牙周組織(圖1B1)相比明顯增加；實驗性牙周炎組織的結合上皮大部分破壞消失，殘留部分上皮細胞S100A8/A9呈強陽性表達(圖1B3)， 其染色強度與健康牙周組織(圖1A3)相比明顯增加。

在實驗性牙周炎的牙齦結締組織中，存在大量的炎癥細胞浸潤，中性粒細胞呈S100A8/A9強陽性表達，S100A8/A9在炎癥細胞浸潤區的成纖維樣細胞呈弱陽性表達(圖1B4)；而在健康牙齦結締組織中，僅存在少量炎癥細胞，S100A8/A9在牙齦成纖維細胞的表達呈陰性(圖1A4)。

2.2 S100A8/A9在比格犬健康及牙周炎根分叉組織中的表達(圖2)

在相對健康牙周組織的根分叉區中，僅存在少量炎癥細胞浸潤，牙槽嵴頂處未見骨吸收(圖2A)，S100A8/A9在牙周膜細胞、血管內皮細胞的表達均為陰性(圖2A1)；在實驗性牙周炎的根分叉區中，存在大量炎癥細胞浸潤，其中中性粒細胞呈S100A8/A9強陽性表達(圖2B)， S100A8/A9在炎癥細胞浸潤區下方的成纖維樣細胞呈弱陽性表達，散在分布的毛細血管內皮細胞也呈S100A8/A9弱陽性表達(圖2B1)。

在相對健康根分叉區的牙槽骨中，可見扁平的骨襯里細胞、脂肪細胞和纖維結締組織的典型組織學結構，S100A8/A9染色均為陰性(圖2A2)；在實驗性牙周炎根分叉區的牙槽骨中，可見少量炎癥細胞浸潤，其中中性粒細胞S100A8/A9呈強陽性表達，骨髓腔中的成纖維細胞呈S100A8/A9弱陽性表達(圖2B2)。

2.3 S100A8/A9在人牙齦成纖維細胞、人牙周膜細胞中的表達(圖3)

為進一步證實牙齦結締組織、根分叉區中，表達S100A8/A9的成纖維樣細胞分別為牙齦成纖維細胞和牙周膜細胞，采用免疫細胞化學法檢測S100A8/A9在原代培養的人牙齦成纖維細胞、人牙周膜細胞中的表達。免疫細胞化學法結果顯示原代人牙齦成纖維細胞、人牙周膜細胞均檢測到S100A8/A9的表達(圖3A、B)。

3 討論

本研究在比格犬相對健康的牙周組織和實驗性牙周炎的組織標本中系統觀察了S100A8/A9的原位表達和分布特點：(1)在健康牙周組織中，S100A8/A9組成性表達于牙齦上皮細胞、中性粒細胞，在結合上皮處呈強陽性表達；在牙周炎組織中，溝內上皮細胞、殘留結合上皮細胞的S100A8/A9表達水平上調，且牙齦成纖維細胞、牙周膜細胞、微血管內皮細胞、骨髓成纖維細胞存在S100A8/A9的誘導表達；(2)在體外培養的人牙周膜細胞、牙齦成纖維細胞中檢測到S100A8/A9的表達，進一步驗證了牙齦成纖維細胞、牙周膜細胞中S100A8/A9的表達。除了前期研究發現S100A8/A9的胞外功能外[18-19]，本研究發現S100A8/A9通過多種牙周組織細胞的胞內功能，可能參與牙周免疫炎癥反應的調控機制。

牙齦上皮細胞是機體抵御病原菌入侵的重要防御體制，包括表面上皮、溝內上皮和結合上皮[5]。完整的溝內上皮和結合上皮構成了牙齦組織的結構性屏障，具有阻擋病原因子從口腔進入牙周支持組織的作用[5]。牙齦上皮除了被動地阻擋微生物的入侵之外，還能通過分泌抗菌肽、活性氧等多種機制主動地參與宿主先天性免疫炎癥反應。研究顯示[5]，結合上皮細胞能產生有效的抗菌物質，如防御素(defensins)和溶酶體酶等。本研究中比格犬健康牙齦上皮中的結合上皮S100A8/A9表達最強，其次是表面上皮、溝內上皮，提示結合上皮通過表達S100A8/A9在先天性免疫防御中發揮最強的抗菌能力。比格犬牙周炎癥病損的牙周袋上皮糜爛潰瘍，一旦表達S100A8/A9的結合上皮完整性被破壞，則宿主難以控制牙周感染。這些證據進一步證明完整的牙齦上皮不僅在牙周組織抗感染方面發揮了物理屏障作用，而且具有生物屏障作用。

與牙周健康組織相比，本研究的牙周炎癥組織的溝內上皮、結合上皮S100A8/A9的表達水平上調，這與之前學者們發表的研究結果一致[15-16]，提示牙齦上皮細胞S100A8/A9的表達水平可能受微生物感染的調控，但其調控機制尚不清楚。Hiroshima等[20]研究發現，上皮細胞能夠識別內毒素，產生并釋放IL-1α，IL-1α可以上調鄰近口腔上皮細胞中抗菌肽(包括S100A8/A9)的表達。因此，牙齦上皮細胞可能以自分泌、旁分泌的方式啟動S100A8/A9依賴的先天性免疫炎癥反應[21]。

A, the expressions of S100A8/A9 in the furcation tissues of periodontal health (lower magnification); B, the expressions of S100A8/A9 in the furcation tissues of periodontitis (lower magnification); A1, the magnified A1 boxed area of A; A2, the magnified A2 boxed area of A; B1, the magnified B1 boxed area of B; B2, the magnified B2 boxed area of B; arrows show fibroblast-like cells expressing S100A8/A9; D, dentin, ab, alveolar bone.圖2 S100A8/A9在健康及實驗性牙周炎根分叉組織中的表達分布Figure 2 The expression and distribution of S100A8/A9 in furcation tissues of periodontal health and experimental periodontitis

A, the expressions of S100A8/A9 in human gingival fibroblasts; B, the expressions of S100A8/A9 in human periodontal ligament cells; C, the negative control of human gingival fibroblasts; D, the negative control of periodontal ligament cells.圖3 S100A8/A9在人牙齦成纖維細胞、牙周膜細胞的表達Figure 3 The expression of S100A8/A9 in human gingival fibroblasts and human periodontal ligament cells

牙齦成纖維細胞、牙周膜細胞分別是牙齦結締組織、牙周膜組織的主要細胞成分，在對抗病原感染時，這些細胞表達模式識別受體、炎癥細胞因子和趨化因子，從而具有某些免疫細胞的功能特點[22-23]。本研究發現牙周炎組的牙齦結締組織、牙周膜組織中的成纖維樣細胞表達S100A8/A9，并在體外培養的牙齦成纖維細胞、牙周膜細胞中檢測到S100A8/A9的表達。胞內S100A8/A9具有廣譜抗菌活性，能夠降低細菌的黏附和入侵，如S100A8/A9能抑制牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)的生長，抑制其黏附于牙齦上皮細胞[24]。本研究牙周炎組織的結合上皮破壞后，表達S100A8/A9的中性粒細胞、牙齦成纖維細胞、牙周膜細胞和骨髓成纖維細胞形成一道屏障，可能起到防止病原微生物進一步向深層牙周組織入侵的作用。

本研究在牙周炎組織中的微血管內皮細胞檢測到S100A8/A9的誘導表達，并可見中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞黏附于微血管內壁。Yen等[25]研究發現，LPS、IL-1β上調小鼠內皮細胞系S100A8、S100A9的表達。微血管內皮細胞來源的S100A8/A9可能通過增強炎癥細胞遷移，招募炎癥細胞至牙周局部，以對抗病原微生物的感染。

綜上所述，S100A8/A9是牙周先天性免疫的重要防御裝置，組成性表達于牙齦上皮細胞和中性粒細胞，維持牙周組織完整和內環境穩態。牙周炎引起S100A8/A9表達于牙齦成纖維細胞、牙周膜細胞、微血管內皮細胞和骨髓成纖維細胞，并上調S100A8/A9在牙齦上皮細胞的表達水平，可能在牙周免疫炎癥反應中發揮抗微生物感染、促炎癥細胞遷移等作用。