外周血淋巴細胞亞群檢測在系統性硬化癥治療中的應用

馬向波，張學武，賈汝琳，高 穎，劉洪江，劉玉芳, 4，李英妮△

(1.北京大學人民醫院風濕免疫科， 北京 100044； 2.邯鄲市第一醫院風濕免疫科， 河北邯鄲 056002； 3.北京大學人民醫院內分泌科， 北京 100044； 4.山西醫科大學第二醫院風濕免疫科， 太原 030000)

系統性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)是一種病因不明、發病機制復雜的慢性自身免疫性疾病，主要病理改變為血管病變，早期出現雷諾現象，之后皮膚或內臟器官逐步纖維化。臨床上根據纖維化的部位是否局限分為局限型和彌漫型，全球SSc患病率為1/10 000[1]，雖然近年來SSc患者生存率有所改善，但其死亡率仍然很高, 尤其是彌漫型，高于其他風濕病[2]。該病雖無特效治療藥物，但使用免疫抑制劑如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、環磷酰胺或環孢素A以及嗎替麥考酚酯等藥物進行早期干預，可提升患者生活質量，改善肺間質纖維化及肺動脈高壓，并可大幅度降低患者的死亡率。SSc患者體內免疫細胞存在過度活化，使用免疫抑制劑可抑制其活化，然而，淋巴細胞被過度抑制后可能產生其他不良結果。本研究擬分析應用激素和免疫抑制劑治療中SSc患者外周血淋巴細胞的變化，探索淋巴細胞亞群檢測在SSc治療中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月至2019年8月在北京大學人民醫院風濕免疫科門診和住院就診的SSc患者32例(SSc組)，其中女性31例，男性1例，平均年齡(50.56±13.60)歲，病程為5(0.5～28)年，32例患者均符合2013年《美國風濕病協會/歐洲風濕病防治聯合會系統性硬化癥分類標準》[3]，流式細胞儀進行檢測前長期或大于1個月持續使用免疫抑制劑，排除患有其他結締組織病、感染性疾病或腫瘤等相關性疾病。年齡、性別與之匹配的30例北京大學人民醫院健康體檢者作為健康對照(healthy control，HC)組，其中女性26例，男性4例，平均年齡(49.07±14.26)歲，HC組與SSc組在性別(P=0.189)和年齡(P=0.27)上差異無統計學意義。本研究獲得北京大學人民醫院醫學倫理委員會批準(批準號：2016PHB168-01)， 所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

淋巴細胞亞群的檢測：采集SSc組及HC組靜脈血4 mL，用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，各取50 μL全血加入2個流式管內，向流式管內分別加入20 μL CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC和20 μL CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC熒光標記抗體(購自深圳邁瑞公司)，混勻，室溫避光孵育15 min，加入500 μL溶血素(購自美國BD公司)，室溫避光孵育15 min，上機檢測(BriCyte E6流式儀，深圳邁瑞公司)，收集細胞數量及比例。按照SSc患者外周血淋巴細胞數量是否降低分為降低組和正常組，比較兩組間臨床實驗室指標的差異。

其他實驗室指標的檢測：采集SSc組及HC組靜脈血4 mL，離心收集血清，分別采用免疫印跡法、免疫比濁法進行以下檢測：硬皮病抗體譜，紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate， ESR)，C-反應蛋白(C-reactive protein, CRP)，免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)A/G/M/，補體(complement,C) 3、C4。

1.3 統計學分析

采用統計軟件SPSS 24.0對數據進行分析，計量資料如符合正態分布，以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson分析；非正態分布的計量資料，以中位數(四分位數)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，相關性分析采用Spearman’s分析。計數資料以百分率表示，采用Fisher精確概率法檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。用百分位數法(95%CI)定義淋巴細胞亞群正常參考值范圍。

2 結果

2.1 一般資料

32例SSc患者中均不同程度地使用激素和免疫抑制劑,如嗎替麥考酚酯、硫唑嘌呤、他克莫司、青霉胺、環孢素A，伴有一種或同時伴有多種臨床表現，如雷諾現象、局限性皮膚改變、彌漫性皮膚改變、指尖潰瘍、皮膚腫脹或硬化、肺間質纖維化、肺動脈高壓、關節炎、抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)陽性、抗硬皮病抗體-70(anti-Scl-70)陽性。

2.2 外周血淋巴細胞亞群計數

SSc患者外周血總T淋巴細胞(CD3+)、CD4+T淋巴細胞(CD3+CD4+)、CD8+T淋巴細胞(CD3+CD8+)、B淋巴細胞(CD3-CD19+)、NK細胞(CD3-CD16+CD56+)數量與HC組相比，均明顯降低(P<0.05，表1)。根據HC組計算95%CI，得到各淋巴細胞亞群數量正常參考值范圍分別為(×106/L)：總T淋巴細胞1 410～1 615,CD4+T淋巴細胞752～897,CD8+T淋巴細胞530～662,B淋巴細胞206～274,NK細胞255～360。SSc組中總T淋巴細胞及各淋巴細胞亞群數量均出現明顯降低，其降低率最低為65.63%，而淋巴細胞數量正常占比最高為34.37%。

表1 SSc患者與正常對照組外周血T淋巴細胞亞群、B細胞及NK細胞的比較Table 1 Comparison of T lymphocyte subsets, B cells and NK cells in SSc patients and HC group

2.3 外周血淋巴細胞亞群百分比

SSc組患者外周血CD4+T細胞占淋巴細胞百分比明顯高于HC組(P=0.017)，而NK細胞的百分比則明顯低于HC組(P=0.004,表2)。

表2 SSc患者與HC組外周血T淋巴細胞亞群、B細胞及NK細胞的百分比Table 2 Percentage of T lymphocyte subsets, B cells and NK cells of peripheral blood between SSc group and HCgroup

2.4 T淋巴細胞亞群、B細胞及NK細胞數量減少與臨床實驗室指標的關系

CD4+T降低組較正常組出現雷諾現象的比例明顯增高(100%vs.66.67%，P=0.024)，ESR(25vs.9，P<0.001)和CRP (7.93vs. 2.21，P=0.018) 均明顯升高(表3)；CD8+T降低組較正常組的紅細胞沉降率明顯增高(23vs. 9，P=0.022,表4)；B細胞降低組較正常組發生指尖潰瘍的比例明顯升高 (50%vs. 9.09%，P=0.019，表5)；NK細胞降低組均較正常組發生指尖潰瘍的比例明顯升高(40%vs. 5.88%，P=0.033)，而IgM水平卻明顯降低(0.77vs. 0.93,P=0.049，表6)。

表3 CD4+T淋巴細胞與臨床實驗室指標之間的關系Table 3 Relationship between CD4+T lymphocyte cells reduction and clinical laboratory index

表4 CD8+T淋巴細胞與臨床實驗室指標之間的關系Table 4 Relationship between CD8+T lymphocyte cells reduction and clinical laboratory index

表5 B細胞與臨床實驗室指標之間的關系Table 5 Relationship between B cells reduction and clinical laboratory index

表6 NK細胞與臨床實驗室指標之間的關系Table 6 Relationship between NK cells reduction and clinical laboratory index

2.5 SSc外周血淋巴細胞數量與實驗室指標之間的相關性

通過相關性分析可得出，ESR與總T淋巴細胞(r=-0.455，P=0.009)、CD4+T淋巴細胞(r=-0.416,P=0.018)、CD8+T淋巴細胞(r=-0.430，P=0.014)、B淋巴細胞(r=-0.366，P=0.039)數量之間存在明顯負相關。然而，T淋巴細胞亞群、B淋巴細胞及NK細胞數量與CRP、IgA、IgG、IgM、C3、C4之間無明顯相關性(P>0.05,表7)。

表7 T淋巴細胞亞群、B細胞及NK細胞數量與ESR、CRP、IgA、IgG、IgM、C3、C4之間的相關性Table 7 Correlation between the number of T lymphocyte subsets, B cells and NK cells and ESR, CRP, IgA, IgG, IgM, C3, C4

3 討論

SSc的發病機制尚不明確，但學者普遍認為,在遺傳易感基礎上，受環境因素誘導免疫系統被激活，進而針對自身組織器官產生過度免疫反應，早期出現血管內皮損傷及炎癥反應，進而造成成纖維細胞活化和基質積聚，最終導致慢性和進行性多器官組織纖維化[4-7]。免疫系統在SSc發病中至關重要，其過度活化是血管病變和纖維化的啟動因素[8-9]。免疫抑制劑可有效抑制淋巴細胞過度活化，緩解SSc患者病情，改善臨床癥狀，是治療SSc的常用藥物。然而，免疫抑制劑的使用可能導致淋巴細胞受到過度抑制，從而影響淋巴細胞的正常免疫功能。本研究發現，使用免疫抑制劑的SSc組外周血中T、CD4+T、CD8+T、B及NK細胞數量明顯低于HC組，且65%以上的SSc患者出現了T、CD4+T、CD8+T、B及NK細胞數量異常，這表明SSc患者中存在淋巴細胞過度被抑制。淋巴細胞亞群百分比的對比結果顯示，SSc組NK細胞百分比明顯低于HC組，而CD4+T細胞百分比卻明顯高于HC組，其他亞群百分比差異無統計學意義，這一結果提示免疫抑制劑的使用導致淋巴細胞被過度抑制，尤其是NK細胞。

雷諾現象是SSc最常見的臨床表現，有報道稱約96%的SSc患者會出現雷諾現象。同時，雷諾現象也是SSc患者最早期出現的典型癥狀，可以在其他器官出現病變前很多年就出現[10-11]。雷諾現象的發生與CD4+T細胞密切相關。CD4+T細胞在內源性或外源性因素刺激下可通過分泌多種炎性細胞因子，如白介素(interleukin，IL)-2，干擾素(inter-feron，IFN)-γ，IL-4, IL-17等，作用于血管內皮細胞和平滑肌細胞，產生炎性損傷，最終導致血管通透性增加，出現雷諾現象[[12-14]。本研究發現，CD4+T細胞數量降低組出現雷諾現象的概率明顯高于CD4+T細胞正常組，但其原因及機制尚不明確，有待進一步研究。

指尖潰瘍是緊隨雷諾現象后常見的SSc的臨床表現，如果治療不當，指尖潰瘍的終生攜帶率高達71.4%， 最終可發展為指端壞疽，疼痛和手功能的喪失將嚴重影響SSc患者的生存質量[15]。以往的研究發現，SSc患者外周血中B細胞活化狀態增強，患者皮膚活檢中存在B細胞及其基因表達異常，與皮膚纖維化相關的細胞因子IL-6水平升高[16-17]。此外，活化B細胞分泌的IL-6可與轉化生長因子-β共同誘導基質合成，抑制膠原降解，最終導致組織纖維化[18-19]。本研究證實使用免疫抑制劑的SSc組存在B細胞數量明顯減少，而且在B細胞降低組，指尖潰瘍的發病率明顯升高，這表明B細胞與指尖潰瘍發生發展密切相關，在免疫抑制劑的使用中應定期檢測B細胞數量，以防B細胞被過度抑制，影響B細胞發揮正常免疫功能。

NK細胞是機體固有免疫系統的重要組成成分，其通過釋放多種細胞因子調節免疫系統中T、B細胞的發育和活化，使后者進入耐受狀態[18]。NK細胞可通過抑制商陸絲裂原PWM誘導的B細胞分化及抗體應答，直接抑制B細胞或抑制B細胞的抗原提呈[20]。本文結果顯示使用免疫抑制劑的SSc組NK細胞數量和百分比均明顯降低，這導致NK細胞抑制B細胞產生自身抗體的作用減弱，加重自身抗體的產生。有文獻報道SSc患者的皮膚纖維化可能與NK細胞的減少有關[21-22]。我們的結果顯示，NK細胞降低組較正常組發生指尖潰瘍的概率明顯升高，進一步證實NK細胞與皮膚纖維化的形成有關。

ESR、CRP是反映SSc疾病活動狀態的常用指標，本研究發現，CD4+T降低組存在ESR和CRP明顯升高，CD8+T降低組也存在ESR明顯升高。此外，相關性分析結果顯示，T、CD4+T、CD8+T及B細胞與ESR呈明顯負相關。這表明，淋巴細胞亞群被過度抑制后SSc的病情可能不但沒有緩解，反而處于活動狀態，也可能因為患者病情重，盡管淋巴細胞亞群被抑制，但疾病仍處于活動狀態，其原因及機制有待進一步研究。

綜上所述，SSc患者治療中免疫抑制劑的使用導致絕大多數患者外周血T、CD4+T、CD8+T、B及NK細胞數量明顯減少，某些淋巴細胞數量的減少可能會增加雷諾現象和指尖潰瘍的發生，加重SSc疾病活動度，因此，在使用免疫抑制劑進行臨床治療SSc中應定期檢測外周血淋巴細胞亞群細胞數量及比例，及時調整免疫抑制劑的使用。