LAPTM4B-35蛋白作為肝癌血清學診斷新標志物的探討

龐 泳，張 沙，楊 華，周柔麗

(北京大學基礎醫學院細胞生物學系， 北京 100191)

LAPTM4B-35是北京大學基礎醫學院細胞生物學系腫瘤細胞分子生物學研究室發現、克隆并鑒定的一個新的人類LAPTM4B基因(NCBI GenBank NM-018407，Gene ID=55353)編碼的蛋白質同型分子之一[1]。經免疫組織化學和免疫印跡分析(Wes-tern blot)表明，LAPTM4B-35蛋白分別在 71.8% (51/71)和76.9% (50/65)的人肝癌組織中表達水平升高2倍以上，其表達水平與肝癌的惡性程度(病理分級)、轉移和耐藥性呈正相關，與患者的術后存活期呈負相關；多因素回歸分析表明，LAPTM4B-35蛋白是肝癌的獨立預后因子[2-3]。更有意義的是，LAPTM4B-35蛋白的過表達還與肝癌這一高復發腫瘤的復發率呈正相關[3]。可見，LAPTM4B-35蛋白可能是一個肝癌診斷、病情監測和預后判斷的新標志物。我們的前期研究還表明，LAPTM4B-35蛋白的過表達可導致細胞的惡性轉化和腫瘤生成[4-5]，促進細胞的生長失控、遷移、侵襲潛能增強[6]和多藥耐藥[7]。通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)敲低腫瘤內源性LAPTM4B基因及其編碼的LAPTM4B-35蛋白可抑制裸鼠體內人肝細胞癌移植物的生長和轉移[8]，因此LAPTM4B-35蛋白可能是一個重要的腫瘤治療新靶標。

很多腫瘤標志物的血清學檢測是通過酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法進行的。ELISA所檢測的血清抗原多為可溶性蛋白質，而LAPTM4B-35是一個4次穿膜的蛋白質[1]，因結構中含4個疏水性的穿膜結構域而具有很強的親脂性，用去垢劑處理細胞裂解液時，其存在于去垢劑相而非水相[9]，因此，欲建立適用的血清學檢測方法就需要了解其在血液中的存在形式。

近年的大量研究表明，脂類和蛋白質在細胞膜中并非均勻分布而是組裝成不同成分、不同特性和不同功能的微區。細胞表面的膜微區經內化形成(胞)內體，進而或再循環至細胞表面，或形成晚期內體/多泡體，多泡體可與質膜融合而釋放多泡體內的小膜泡到細胞外，如此釋放的小膜泡稱為外排體(exosome)。各種正常細胞和腫瘤細胞都釋放多種由不同分子組成的外排體，因此可存在于血液、尿液、羊水、胸水和腹水中。各種外排體均具有一些共同的特性，如直徑在30～100 nm、具有相同的密度和脂雙層膜、具有共同的和細胞類型特異的蛋白質位于其膜中或腔內。在外排體膜中最普遍存在的是4次穿膜蛋白質[10-11]。外排體含有其來源細胞所特有的蛋白質，來自于腫瘤細胞的則含有腫瘤相關抗原，因而可用于腫瘤的診斷或作為腫瘤疫苗[12-18]。

本文通過ELISA和Western blot方法鑒定肝癌患者血清中和肝癌細胞的培養上清液中是否存在LAPTM4B-35蛋白，旨在探討體內生長的惡性腫瘤細胞是否釋放LAPTM4B-35抗原到血液中以及其在血液中的存在形式，為建立血清學定量檢測診斷方法奠定基礎，并探討LAPTM4B-35蛋白作為肝癌診斷新標志物的應用價值。

1 資料與方法

1.1 材料

BEL-7402人肝細胞癌細胞系由本研究室保存，針對LAPTM4B-35蛋白兩個表位的多抗(LAPTM4B-N10-pAb和LAPTM4B-EC2-pAb)由本研究室用鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)耦聯的兩個10肽抗原免疫兔制備抗血清，并經Protein A和抗原-親和柱純化為高親和性的IgG。LAPTM4B-EC1-mAb由北京晶美生物技術公司制備，BSA-EC2-10肽抗原由中國科學院化學研究所合成及耦聯。

肝癌組織(手術切除標本)和患者血清由中國人民解放軍第302醫院(現名中國人民解放軍總醫院第五醫學中心)肝膽外科提供，新鮮組織于手術離體后立即放入液氮中冷凍，然后置-80 ℃凍存。

應用的儀器和試劑包括：100 ku MWCO Centriplus離心超濾管(Millipore公司)、96孔酶標板(Nunc公司)、DMEM培養基(Invitrogen公司)、新生牛血清(Biochrom，德國)、重水(美國CIL，國內分裝)、考馬斯亮藍G250和R250(Sigma公司)、NC硝酸纖維素膜(Whatman公司)、ECL化學發光試劑盒(Pierce公司)、BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)、Purified mouse anti-Integrin α5 MAb(BD公司)、Goat Anti-Rabbit IgG-HRP和Goat Anti-mouse IgG-HRP(Santa Cruz 公司)。

細胞裂解液：Tris-Cl (pH 7.6) 10 mmol/L、NaCl 150 mmol/L、EDTA 1 mmol/L、0.5%(體積分數)NP40、PMSF 1 mmol/L、aprotinin 1 mg/L、Pepstatin A 1 mg/L。

ELISA包被緩沖液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)，封閉液為含3%(體積分數)BSA的PBS溶液(pH 7.4)，洗板液為含0.05%(體積分數)Tween-20的PBS溶液(pH 7.4)，稀釋液為含1%(體積分數)BSA的PBS溶液(pH 7.4)，底物反應液為0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 5.0)，反應終止液為4 mol/L H2SO4。

1.2 細胞培養

BEL-7402人肝細胞癌細胞用內含1%(質量分數)青霉素、鏈霉素，10%(體積分數)新生牛血清的DMEM培養基培養，置于37 ℃、5%(體積分數)CO2細胞培養箱中，細胞生長至對數期時收集細胞培養上清液。

1.3 總蛋白的提取

1.3.1細胞總膜蛋白的提取 取長勢良好的細胞，經PBS漂洗后，用0.25%(質量分數)粗胰酶消化，離心，棄去上清液，在細胞沉淀中加入適量預冷的含去垢劑的細胞裂解液，于1 200 W功率、冰浴中間斷超聲處理共2 min (實際超聲1 min)，然后置于冰浴中30～60 min。于12 000×g、4 ℃下離心15 min以去除細胞碎片，上清液中含細胞的總膜蛋白，凍存于-80 ℃備用。

1.3.2組織總膜蛋白的提取 將凍存的經組織病理確診為肝細胞癌的腫瘤組織置于冰上，用剪刀剪成小碎塊，挑取約0.1 g濕重組織放入手動玻璃勻漿器中，每管加入1 mL預冷的含去垢劑的細胞裂解液，于冰浴中充分勻漿，超聲處理及之后的操作同上。

1.4 外排體的分離與純化

將收集的細胞培養上清液500 mL經300×g、4 ℃離心10 min，去除細胞取上清液；1 200×g、4 ℃離心10 min，去除死細胞，收集上清液；10 000×g、4 ℃離心20 min，去除細胞碎片，收集上清液。經100 ku MWCO Centriplus 離心超濾管超濾濃縮(1 200×g、4 ℃離心45 min)得到10 mL濃縮液，將濃縮液均分為4份，每份用PBS溶液稀釋補足至4 mL并混勻，然后移至5 mL超速離心管中，該管底鋪有1 mL用重水配置的30%(質量分數)蔗糖墊，經100 000×g、4 ℃超速離心45 min，收集底部的液體1.5 mL，再連續兩次使用PBS溶液稀釋至5 mL，同等條件下超速離心，收集底部含外排體的沉積物，用PBS稀釋至2.5 mL，作為外排體提取物置于-80 ℃保存備用[19]。

1.5 外排體所含蛋白質的定量測定

使用Bradford法檢測外排體的蛋白質濃度。

1.6 分離蛋白質組分

取外排體懸液30 μL或同等蛋白質含量的BEL-7402細胞膜提取物，加入適量的4×上樣緩沖液，100 ℃煮沸3 min，上樣于10%(體積分數)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分離膠的頂部，電泳結束后進行考馬斯亮藍染色，脫色后使用凝膠成像系統掃描，并用Scion Image對凝膠圖像進行分析。

1.7 Western blot分析

取肝癌患者血清5 μL、或正常人血清5 μL、或外排體懸液60 μL及同等蛋白質含量的肝癌組織膜提取物，于SDS-PAGE電泳后，將分離膠轉移至硝酸纖維素膜。5%(質量分數)脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入anti-LAPTM4B-N10pAb或anti-Integrin α5 mAb作為一抗，分別按照體積比1 ∶1 000、1 ∶2 000稀釋，4 ℃孵育過夜。分別加入Goat Anti-Rabbit IgG-HRP、Goat Anti-mouse IgG-HRP(體積比1 ∶3 000稀釋)室溫孵育1 h，最后用ECL化學發光試劑盒進行放射自顯影并掃描結果。

1.8 ELISA直接法分析肝癌細胞釋放的外排體及肝癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白

用包被液將BSA-EC2-10肽以體積比1 ∶1 000稀釋(原液濃度為1 g/L)，外排體提取物原液及肝癌患者血清按照體積比1 ∶10稀釋(即原液10 μL，包被液90 μL)后包被酶標板，同時設置陰性對照組，4 ℃孵育過夜。用3%(體積分數)BSA于37 ℃封閉2 h后，加入LAPTM4B-EC2-pAb作為一抗(體積比1 ∶1 000稀釋)37 ℃孵育1.5 h，加入Goat Anti-Rabbit IgG-HRP作為二抗(體積比1 ∶2 000稀釋)37 ℃孵育40 min，其余步驟按照常規的直接法ELISA程序操作，但洗板時動作要輕柔，最后測定光密度(D492 nm)并分析結果。

1.9 ELISA夾心法分析正常人和原發性肝細胞癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白

以Anti-LAPTM4B-N10-pAb為捕獲抗體包被酶標板(1 mg/L)，置于4 ℃過夜，封閉2 h，常規洗板4次(用PBST洗3次，第4次用雙蒸水洗，每孔300 μL，每次3 min)，然后加入血清50 μL/孔，于37 ℃孵育2 h，洗板后加入檢測抗體Anti-EC1-mAb(100 μL/孔)，于37 ℃孵育1.5 h，洗板4次后加入新鮮配制的底物反應液(100 μL/孔)，于37 ℃避光顯色至空白D492 nm的讀數值控制在1.0左右，用2 mol/L H2SO4終止反應，加50 μL/孔，震蕩混勻，測定492 nm處光密度值(D492 nm)。

1.10統計學分析

采用SPSS 12.0軟件進行統計學分析，計量資料以三次獨立實驗數據的均值±標準差表示，等級資料以中位數(最小值，最大值)表示，組間兩兩比較采用Student’st檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌患者血液中LAPTM4B-35蛋白的鑒定

2.1.1Western blot鑒定肝癌患者和正常人血清中的LAPTM4B-35蛋白 用自制、純化的anti-LAPTM4B-N10pAb多抗對肝癌患者和正常人血清中的LAPTM4B-35蛋白進行Western blot分析，結果表明，不論是肝癌患者還是正常人血清中都含有LAPTM4B-35蛋白，肝癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白似乎高于正常人(圖1)。

2.1.2ELISA直接法鑒定肝癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白 直接以肝癌患者的血清或化學合成的BSA-EC2-10肽多價抗原包被酶標板，用LAPTM4B-EC2-pAb多抗進行ELISA檢測，與Wes-tern blot結果一致，ELISA直接法檢測的肝癌患者血清中存在LAPTM4B-35抗原，且含量顯著高于陰性對照組，兩組差異有統計學意義(P<0.001, 圖2)。但是，LAPTM4B-35含量低于BSA-EC2-10肽抗原的陽性對照組，其原因一方面可能由于外排體中含有多種蛋白質，LAPTM4B-35蛋白只占其中的一部分，而BSA-EC2-10肽是多價的純抗原，故可與抗體結合的有效抗原濃度差別很大；另一方面可能由于血液中的LAPTM4B-35蛋白并非可溶性分子，而以外排體形式存在，以致其被酶標板表面吸附的效率和牢度不如可溶性的合成抗原短肽。

2.2 肝癌細胞培養上清液中的外排體蛋白質定量

根據標準曲線得出的公式:y=0.012 4x+0.085 3,計算出肝癌細胞培養上清液的外排體提取物中蛋白質濃度約為0.969 0 g/L。

2.3 肝癌細胞培養上清液中外排體的SDS-PAGE分析譜

以SDS-PAGE分析肝癌細胞培養上清液中外排體的蛋白質組分，結果見圖3。在蛋白質總量相等的情況下，來源于BEL-7402肝癌細胞培養上清液的外排體蛋白質組分總體上比細胞膜總提取物的蛋白質組分簡單，其中有的成分得到富集，有的成分有所減少，表明外排體中的蛋白質組分與細胞膜總提取物中的組分不同。

P1 and P2, serum from HCC patients; H1, serum from normal indivi-dual.圖1 Western blot分析正常人與肝癌患者血清中LAPTM4B-35蛋白的表達Figure 1 Western blot analysis of LAPTM4B-35 protein in serum of healthy individual and hepatocellular carcinoma patients

* P<0.001, serum group vs. blank control group.圖2 ELISA直接法分析肝癌患者血清中LAPTM4B-35蛋白的表達Figure 2 Direct ELISA analysis of LAPTM4B-35 protein in serum of hepatocellular carcinoma patients

1, molecular marker; 2, cellular extracts; 3, exosomes.圖3 SDS-PAGE分析BEL-7402肝癌細胞來源的外排體和細胞膜提取物中的蛋白質組分Figure 3 SDS-PAGE profiles of cellular extracts and exosomes from BEL-7402 hepatocellular carcinoma cells

2.4 肝癌細胞培養上清液的外排體中所含LAPTM4B-35蛋白

采用Western blot分析LAPTM4B-35蛋白在肝癌組織膜提取物和BEL-7402肝癌細胞培養上清液來源的外排體中的表達，結果表明二者均存在LAPTM4B-35蛋白，其在肝癌組織膜提取物中的表達量高于外排體(圖4)。

2.5 ELISA檢測肝癌細胞釋放的外排體中的LAPTM4B-35蛋白

直接用外排體提取液或BSA-EC2-10肽包被96孔板，使用LAPTM4B-EC2-pAb進行檢測，得到陽性結果，即外排體中含有LAPTM4B-35蛋白。BSA-EC2-10肽對照組的D492 nm為0.944 7±0.105 5，外排體組的D492 nm為0.594 3±0.111 1(空白對照組的D492 nm為0.106 0±0.015 5)。

1 and 2, tumor tissues; 3 and 4, exosomes.圖4 Western blot鑒定LAPTM4B-35蛋白在肝癌組織膜提取物和來源于BEL-7402肝癌細胞外排體中的表達Figure 4 Western blot profiles of LAPTM4B-35 protein in membrance extracts from hepatocellular carcinoma tissues and exosomes from BEL-7402 hepatocellular carcinoma cells

外排體組的包被蛋白質總量遠高于BSA-EC2-10肽組(10.0 ∶0.1 μg)，但是前者的D492 nm值約為后者的2/3，一方面是因為在外排體中還含有LAPTM4B-35蛋白以外的其他蛋白質，另一方面是因為外排體以小囊泡的形式存在，不容易被96孔板吸附，而且在洗板時容易脫落。

圖5結果顯示，ELISA直接法檢測肝癌細胞釋放的外排體中的LAPTM4B-35蛋白含量顯著高于空白對照組，兩組差異有統計學意義(P<0.001)。

* P<0.001, exosomes group vs. blank control group.圖5 ELISA直接法鑒定外排體中的LAPTM4B-35蛋白Figure 5 LAPTM4B-35 protein in exosomes identified by direct ELISA

2.6 ELISA檢測肝細胞癌患者和正常人血清中的LAPTM4B-35蛋白

采用以Anti-LAPTM4B-N10-pAb為捕獲抗體，以anti-EC1-mAb為檢測抗體的ELISA雙抗體夾心法檢測33例正常人和43例肝細胞癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白，結果顯示，肝癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白含量顯著高于正常人，兩組差異有統計學意義(圖6，P<0.001)。

P<0.001, normal vs. HCC. Normal, normal individuals (n=33); HCC, hepatocellular carcinoma patients (n=43).圖6 ELISA夾心法檢測正常人和肝癌患者血清中LAPTM4B-35蛋白水平Figure 6 LAPTM4B-35 protein levels in serum from normal individuals and hepatocellular carcinoma patients detected by sandwich ELISA

3 討論

在世界范圍肝癌占腫瘤死亡的第4位或第5位，在中國為第3位，某些地區為第1位。每年全球肝癌新發病例84.1萬，中國新發病例39.3萬，占全球肝癌新發病例的46.7%，每年全球因肝癌死亡病例78.2萬，中國為36.9萬，占全球肝癌死亡病例的47.2%，而且發病年齡也趨于年輕化。肝癌的治愈率低而復發率高，嚴重威脅人們健康。肝癌治愈率低的主要原因之一是缺乏早期診斷和病情監測的靈敏指標。影像診斷的準確性高而靈敏度低，組織病理診斷是診斷的金標準但需要有創采得腫瘤組織。目前廣泛采用的肝癌血清學標志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)靈敏度高而特異性不夠，其假陰性和假陽性率均為30%，因此，迫切需要探索新的肝癌診斷標志物。本研究室發現、克隆和鑒定的LAPTM4B基因編碼的LAPTM4B-35蛋白在76.9%的肝癌組織中表達上調2倍以上，61.5%上調4倍以上，其表達水平與肝癌的惡性度、生長速度、轉移、復發、多藥耐藥以及患者的術后存活期等均有良好相關性，而且是一個很好的獨立預后因子和治療靶標[20]。本文通過Western blot和ELISA法檢測到肝癌細胞培養上清液中存在含LAPTM4B-35蛋白的外排體，兩種方法都表明肝癌患者的血液中也存在LAPTM4B-35蛋白，鑒于其不溶于水的親脂性，推測其存在形式可能也是外排體。

關于外排體的生物生成、釋放和生物學活性以及在疾病診斷與治療上的應用近年頗受重視，近年的相關研究數量很多。血液、尿液及各種分泌物中外排體的檢測和應用已引起醫學界關注，被認為在腫瘤診斷和治療中有良好的應用前景，特別是在前列腺癌[13]、卵巢癌[14]和鼻咽癌[15]的診斷中。然而，由于外排體是不均一的小囊泡而非可溶性分子，而且整合在外排體中的膜分子存在方向性，在建立ELISA檢測方法上難度較大。

本研究采用ELISA雙抗體夾心法檢測結果表明，肝癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白水平顯著高于正常人，為建立適用于臨床血清學診斷的方法奠定了基礎。由于觀察時間短，對于患者血清中的LAPTM4B-35蛋白水平與腫瘤復發、轉移的關系尚難得出結論。應用這種檢測方法診斷肝癌的特異性和靈敏度，以及與AFP相比的優劣情況，有待進行更大樣本量的分析以得出結論。

2019年美國MyBio Source Inc.公司推出了檢測LAPTM4B-35蛋白的ELISA試劑盒，德國明斯特(Münster)大學醫院與武漢大學肝膽疾病研究院合作使用該試劑盒檢測胰腺導管腺癌患者(169例)、慢性胰腺炎患者(40例)和正常人(30例)血清中LAPTM4B-35蛋白的水平，結果表明，LAPTM4B-35蛋白在胰腺導管腺癌的腫瘤組織和患者血清中的表達水平比正常人和慢性胰腺炎患者顯著增加，且血液中LAPTM4B-35蛋白水平低的患者術后無復發存活期和總存活時間較長[21]。這項研究為采用ELISA方法檢測血液中LAPTM4B-35蛋白水平的可行性和以其作為某些惡性腫瘤的診斷和預后標志物提供了進一步的佐證。

[志謝：感謝中國醫學科學院腫瘤醫院肝膽外科吳健雄主任和劉立國醫生、中國人民解放軍第302醫院(現名中國人民解放軍總醫院第五醫學中心)肝膽外科劉振文主任和齊瑞兆醫生以及北京大學腫瘤醫院檢驗科張青云主任對本研究提供的幫助]。