液相色譜-串聯質譜法測定腐乳中的生物胺

陳召桂，鄭國建，朱玲琳

（1.浙江五芳齋實業股份有限公司，浙江嘉興 314031；2.上海市質量監督檢驗技術研究院，上海 200233）

腐乳是我國具有民族特色的傳統大豆發酵食品，被稱為“中國干酪”[1]，年產量達3萬t[2]。腐乳在中國擁有1 800余年的歷史[3]，受到國內外消費者的喜愛。我國傳統腐乳較多采用開放式發酵工藝，加工工藝粗放，手工操作環節較多，同時腐乳經微生物發酵后含有豐富的氨基酸，為生物胺的形成提供了較好的條件[4-6]。盡管生物胺在機體內具有重要的生理功能，但當人體攝入過量時會引起中毒反應（如頭痛、頭暈、高血壓、心悸等），嚴重的甚至危及生命[7-8]。

用于食品中生物胺測定的方法包括薄層色譜法[9]、毛細管電泳法[10]、氣相色譜法[11]、離子色譜法[12-13]、柱前衍生液相色譜法[14-15]和液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[16-17]等。現行有效的國標方法為GB 5009.208—2016《食品安全國家標準食品中生物胺的測定》[18]，該標準中試樣用5%三氯乙酸提取，正已烷去除脂肪，三氯甲烷-正丁醇（1∶1，V/V）液液萃取凈化后，用丹磺酰氯進行柱前衍生，并用高效液相色譜-紫外檢測器進行定量分析。在實際檢測過程中，腐乳中存在較多的游離氨基酸，會和丹磺酰氯進行反應，容易對生物胺的檢測造成較大干擾[19]。本實驗將建立一種液相色譜-串聯質譜法檢測腐乳中生物胺的方法，為生產中快速測定腐乳中的生物胺含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

組胺（histamine，HIST）、酪胺（tyramine，TYR）、尸胺（cadaverine，CAD）、腐胺（putrescine，PUT）、色胺（tryptamine，TRP）、精胺（spermine，SPM）、亞精胺（spermidine，SPD）、苯乙胺（phenylethylamine，PEA）、章魚胺（octopamine，OCT）（純度均≥99%）：美國Sigma公司；甲酸、三氟乙酸、乙腈（色譜純）：德國Merck公司；濃鹽酸、三氯乙酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；超純水由Millipore Milli-Q超純水儀生產；腐乳樣品（白1、白2、白2、紅1、紅2、紅3、臭1、臭2、臭3、臭4）：市售。

1.2 儀器與設備

XEVO TQXS 液相色譜-串聯質譜儀（配有電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI））：美國Waters公司；5804離心機：德國Eppendorf公司；Votex3000渦旋振蕩儀：德國Wiggens公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

采用Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱。流動相A為0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫：0～1 min，95%A保持不變；1～6 min，95%A線性變化至0%A；6～8 min，0%A保持不變；8.1 min變化至95%A，平衡2 min。柱溫：35 ℃。流速：0.3 mL/min。進樣量：2 μL。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子（electrosprayionization，ESI）源，正電離模式；毛細管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：30 V；干燥氣溫度：400 ℃；干燥氣流速：800 L/h；錐孔反吹氣流速：150 L/h；離子源溫度：150 ℃；離子對、碰撞能量見表1。

表1 質譜參數Table 1 Parameters of mass spectrometer

1.3.3 標準溶液的配制

稱取9種生物胺標準品各10 mg于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液。分別取1.0 mL生物胺單組分標準儲備液于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，配制成10 μg/mL的混合標準溶液。使用初始流動相將混合標準溶液稀釋成10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、150ng/mL、200 ng/mL系列質量濃度標準溶液。

1.3.4 樣品處理

取出腐乳約10 g于均質機中混勻，取1 g混勻后的樣品，加入30 mL 5%三氯乙酸水溶液，渦旋混勻15 s后超聲提取30 min。取出后用5%三氯乙酸水溶液定容至50 mL。8 000 r/min離心2 min，上清液經0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜后供LC-MS/MS儀器測定。

2 結果與分析

2.1 腐乳前處理方法的優化

生物胺具有較強的極性，前處理時還需要沉淀樣品中的蛋白質和肽段等雜質，所以試驗中考察了三種提取試劑的提取效果，分別是乙腈-水溶液（8∶2，V/V）、0.1%甲酸乙腈-水（8∶2，V/V）和5%三氯乙酸水溶液。使用上述三種提取溶劑處理同一腐乳樣品，進行液相色譜-串聯質譜分析后，比較三種處理方法得到的各生物胺的相對峰面積如圖1所示。

圖1 不同提取試劑的提取效果Fig.1 Extraction effect of different extraction solvents

由圖1可知，3種提取溶劑具有相近的提取效果，相對偏差＜10%。而5%三氯乙酸水溶液相對于其他兩種提取溶劑的提取效率略高，故選取5%三氯乙酸水溶液進行樣品前處理。

2.2 液相色譜-串聯質譜條件的優化

在優化液相色譜條件時，考察了乙腈-水體系、乙腈-0.1%甲酸水體系、以及乙腈-0.1%三氟乙酸水體系，結果見圖2。

由圖2可知，由于部分生物胺極性較大，所以在乙腈-水體系、乙腈-0.1%甲酸水體系的色譜條件下基本沒有保留，不易和樣品中的雜質分離。而使用乙腈-0.1%三氟乙酸水體系時這部分生物胺保留得到改善，因此最終選擇乙腈-0.1%三氟乙酸水體系進行后續研究。

2.3 基質效應

質譜的基質效應是指樣品中復雜的干擾物對分析物質譜響應的抑制或增強，可用基質標準曲線與標準校準曲線斜率的比值進行評估[21]。結果表明，組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、精胺、亞精胺、苯乙胺、章魚胺在腐乳基質中的基質效應比值分別為0.92、0.91、0.85、0.88、0.82、0.89、0.87、0.94、0.84，在0.82～0.94之間，表明9種生物胺的響應被樣品中的干擾物質輕微抑制。

2.4 線性關系、檢出限和定量限

使用初始流動相將混合標準溶液稀釋成系列質量濃度標準溶液，進行液相色譜-串聯質譜分析。以標準工作液質量為橫坐標，各生物胺峰面積為縱坐標制作標準曲線（表2），各分析物的標準曲線的相關系數R2均＞0.999，線性相關性較好。

表2 9種生物胺的線性范圍和線性關系Table 2 Linear range and relationship of 9 biogenic amines

取混合標準溶液用5%三氯乙酸水溶液稀釋后測定，以3倍信噪比作為方法的檢出限，以10倍信噪比作為方法的定量限，獲得目標物的檢出限和定量限。本方法針對9種生物胺的檢出限為0.03 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg。

2.5 回收率和精密度

由于腐乳中含有較高含量的生物胺，所以為了消除本底對加標回收的影響，本實驗選取了一款本底生物胺含量較低的紅腐乳進行基質加標回收率實驗，添加量為10 mg/kg和20 mg/kg，平行測定6次，結果見表3。

由表3可知，加標回收率在85%～101%之間，相對標準偏差（relative sandard deviation，RSD）在0.9%～4.8%之間，因此該方法用來檢測腐乳中生物胺的含量是可靠的。

表3 腐乳中生物胺的回收率及方法精密度試驗Table 3 Recovery and method precision tests of biogenic amine in sufu

2.6 實際樣品中生物胺的檢測

采用本方法對市售的10批次不同企業生產的腐乳中生物胺含量進行測定（表4）。結果表明腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、色胺、2-苯乙胺、組胺、酪胺以及章魚胺在腐乳中的含量范圍分別是：1.47～169 mg/kg、＜50.7 mg/kg、未檢出、未檢出、＜116 mg/kg、0.22～128 mg/kg、＜120 mg/kg、1.41～191 mg/kg、未檢出。同一品種的腐乳中生物胺含量存在顯著差異，可知其加工工藝存在很大區別，或生產的環境良莠不齊。為保證產品的穩定性，有必要對其加工過程制定相應的良好操作規范。

表4 實際樣品中生物胺含量的測定結果Table 4 Determination results of biogenic amines in samples

3 結論

本研究建立了一種使用液相色譜-串聯質譜法測定腐乳中9種生物胺的方法。該方法中9種生物胺在質量濃度為10～200 ng/mL范圍內線性相關系數R2＞0.999；檢出限為0.03 mg/kg；定量限為0.1 mg/kg；該方法具非常好的準確度和精密度，回收率在85%～101%之間，相對標準偏差為0.9%～4.8%，適用于腐乳中生物胺的測定。使用該方法對實際樣品進行檢測，生物胺含量在不同品種、不同生產企業間的腐乳中差異較大，說明我國傳統腐乳的加工環境、加工工藝沒有統一的良好操作規范，急需腐乳行業引起重視。