復方金釵石斛保健酒緩解小鼠體力疲勞的研究

牛曼思，童鈺琴，李 姝，楊 陽，汪小玉，張家偉，王松濤，稅丕先

（1.瀘州品創科技有限公司，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學藥學院，四川瀘州 646000）

疲勞是指機體在生理過程中，不能維持其機能的特定水平或器官原有的運動強度時呈現的生理現象。長期處于疲勞狀態造成的機體免疫功能紊亂和器官損傷，會嚴重威脅人類健康[1-2]。長久以來，國際上在緩解疲勞治療中的主流對策為藥物治療，一方面藥物治療起效迅速，效果顯著；但另一方面常規藥物治療所帶來的副作用、成癮性和依賴性，極大地限制了其臨床應用范圍[3-4]。中醫藥長期臨床研究表明，許多傳統中藥對緩解和治療疲勞有積極作用，并表現出低毒副作用等優勢，受到國內外學者的廣泛重視[5]。

金釵石斛（Dendrobium nobileLindl.）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，味甘、淡，性屬微寒，是歷版《中國藥典》所記載的名貴中藥材，被國際藥用植物界稱為“藥界大熊貓”，現代藥理學研究表明，金釵石斛中含有的主要活性成分包括倍半萜類、黃酮類、多糖類以及相關衍生物[6]。因其具備的較高藥用價值，金釵石斛已被廣泛地開發成種類繁多的藥品和保健食品，產品功效主要包括抗氧化、增強免疫力、緩解體力疲勞、清咽潤喉等[7-9]。然而，單味中藥作用較為單一，中醫藥常以整體論治，通常認為復方中藥相比起單味藥材可以從多靶點多角度緩解疲勞。根據中醫理論，研究將補虛扶正和祛疲安神作為出發點[10]，以金釵石斛配伍人參、黃芪、五味子、茯苓四味中藥組成復方，五藥配合，意在益氣生津，補陰助陽。同時，研究以白酒作為復方溶媒，能夠極大程度地將藥材中的多酚類、倍半萜類等醇溶性成分溶出，增強藥理活性[11-12]，最終成品可兼具口感好、功效強、穩定性好等優點。

根據衛生部關于進一步規范保健食品原料管理的通知（衛法監發[2002]51號）附件1及附件2中名單中的原料及其他保健食品可用原料，組方中人參、黃芪、茯苓為藥食同源中藥，石斛和五味子為可用于保健食品的中藥?；谥嗅t藥理論以及現代藥理研究，本研究依據《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》對復方金釵石斛保健酒進行緩解體力疲勞功效驗證，為開發天然、無毒副作用的緩解體力疲勞類保健食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）昆明種雄性小白鼠：體質量18～22 g，雄性，由西南醫科大學實驗動物中心提供。生產許可證號：SCXK（川）2013-17，使用許可證號：SCXK（川）2013-065。實驗動物飼養于西南醫科大學實驗動物中心，室溫22～24 ℃，濕度65%～80%。給藥期間，動物分籠以全價顆粒飼養，自由飲水。

尿素氮試劑盒、全血乳酸檢測試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司；肝糖原測定試劑盒：南京建成生物工程檢驗所；金釵石斛藥材（經西南醫科大學生藥教研室稅丕先教授鑒定為蘭科石斛屬植物金釵石斛）：采自瀘州合江金釵石斛種植基地；人參飲片、五味子飲片、黃芪飲片、茯苓飲片：瀘州百草堂中藥飲片有限公司；濃香型白酒（52%vol）：由瀘州老窖提供。

1.2 儀器與設備

UV-I800PC 紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；Multiskan FC型酶標儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；FA2204B電子天平：上海精科天美科學儀器有限公司；HHS.21-4恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；BPX-272恒溫培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 復方金釵石斛保健酒的生產工藝流程及操作要點

人參、金釵石斛、黃芪、五味子、茯苓→打粉→浸潤→滲漉→收集→提取液檢驗→計量稱質量→配液→初濾→精濾→灌裝→封口→燈檢→包裝→檢驗

操作要點：

藥材前處理：將藥材粉碎至65～80目的藥粉，按人參∶金釵石斛∶黃芪∶五味子∶茯苓（9∶6∶6∶2∶2）的比例混合。

浸潤：按照藥材粉∶白酒=1∶9（g∶mL）的比例加入酒精度為52%vol的濃香型白酒，在室溫（25～28 ℃）條件下浸潤18h。

滲漉：以5 mL/（min·kg）的流速滲漉至料液比為1∶12（g∶mL）。

配液：以濃香型白酒為基礎將提取液調配成酒精度為38%vol。

廠家推薦成人（體質量以60 kg計），每日攝入量為100 mL/60 kg。根據前期研究測定[13]，金釵石斛復方保健酒的功效成分及含量為石斛堿183.37 mg/L、總黃酮219.74 mg/L。

1.3.2 劑量設計

參照《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003版）保健酒緩解體力疲勞實驗。將小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為樣品低劑量組（LD）、中劑量組（MD）、高劑量組（HD），溶媒基酒組（BC），空白對照組（NC）。灌胃給藥0.2 mL/10 g，每天1次，連續30 d，實驗期間小鼠自由飲水、攝食，稱量體質量。各組給藥如下：實驗組低、中、高劑量組小鼠灌胃給予劑量相當于人體給藥量的5倍、10倍、20倍，即8.4 mL/kg、16.7 mL/kg、33.4 mL/kg；溶媒對照組小鼠灌胃給予：等體積15%vol濃香型白酒；空白對照組小鼠灌胃給予：等體積生理鹽水。

1.3.3 小鼠體質量增長測定

小鼠連續灌胃30 d，每日1次。分別在小鼠灌胃0 d、15 d、30 d時稱量小鼠體質量。

1.3.4 小鼠負重游泳實驗

小鼠連續灌胃30 d，末次給試樣24 h后將小鼠負體質量5%的鉛皮，放入水深30 cm，水溫（25±0.5）℃的游泳箱內，記錄小鼠自放入游泳開始至死亡的時間（以小鼠頭部沉水后8 s無法上浮，放于平面無法完成翻正反射作為力竭判斷標準）。

1.3.5 小鼠血乳酸（blood lactic acid，BLA）實驗

連續灌胃30 d，末次灌胃給予受試酒24 h后尾靜脈采血50 μL，采血后在溫度為30 ℃的水中游泳10 min后停止，立即采血50 μL，休息20 min后眼球再采血50 μL。靜置3 h后分離得血清，按照試劑盒方法測血乳酸含量。并根據下式計算出血乳酸曲線下面積：

式中：S表示血乳酸曲線下面積；H0表示游泳前血乳酸值，mmol/L；H1表示游泳后0 min血乳酸值，mmol/L；H2表示游泳后休息20 min血乳酸值，mmol/L。

1.3.6 小鼠血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）實驗

連續灌胃30 d，末次給受試物24 h后分別將各組小鼠無負重分別放入水溫30 ℃水中游泳90 min，休息60 min后采眼球血0.5 mL，放置3 h后分離血清，用酶法試劑盒測定尿素氮。

1.3.7 小鼠肝糖原實驗

精確稱取肝臟100 mg，生理鹽水洗凈濾紙吸干多余水分，按照試劑盒方法將樣本與堿液按1∶3加入試管，沸水浴20 min，流水冷卻，將肝糖原水解液配制成1%檢測液，配制空白與標準，混勻，沸水浴5 min，冷卻，于波長620 nm處比色，按照肝糖原測定試劑盒操作說明書計算肝糖原含量。

1.3.8 小鼠肝腎組織病理學檢查

連續灌胃30 d，末次給受試物24 h后取出肝和腎，放于10%甲醛溶液中。經HE染色制作病理切片。

1.3.9 數據處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理，所有數據均以表示。利用T檢驗，首先檢驗方差齊性，再對組間分析，P≤0.05則差異有統計學意義，P≤0.01差異有顯著統計學意義。

2 結果與分析

2.1 復方金釵石斛保健酒對小鼠體質量的影響

灌胃30 d期間，小鼠無異常反應，皮毛光亮，精神狀態較好。由表1可知，各組小鼠初始體質量均衡（P＞0.05），中期和末期各組小鼠的體質量差異均無統計學意義（P＞0.05），說明樣品對小鼠的生長無不良影響。

表1 復方金釵石斛保健酒對小鼠體質量的影響Table 1 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on mice body mass

2.2 復方金釵石斛保健酒對小鼠負重游泳的影響

由表2可知，基酒組與空白組對比差異無統計學意義（P＞0.05）；中劑量組小鼠游泳時間顯著長于空白組和基酒組（P＜0.05）。

表2 復方金釵石斛保健酒對小鼠負重游泳的影響Table 2 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the loaded-swimming of mice

2.3 復方金釵石斛保健酒對小鼠血乳酸含量的影響

由表3可知，游泳前5組小鼠血乳酸含量差異不顯著（P＞0.05）；游泳10 min后中劑量組小鼠的血乳酸含量顯著低于空白組、基酒組（P＜0.05），高劑量組小鼠的血乳酸含量極顯著低于空白組、基酒組（P＜0.01）；游泳結束后20 min，5組小鼠血乳酸含量差異不顯著（P＞0.05）。經計算，中劑量組、高劑量組小鼠的血乳酸曲線下面積極顯著低于空白組、基酒組（P＜0.01）。復方金釵石斛保健酒可以通過降低小鼠運動后血乳酸堆積緩解體力疲勞。

表3 復方金釵石斛保健酒對小鼠血乳酸的影響Table 3 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the blood lactic acid of mice

2.4 復方金釵石斛保健酒對小鼠血清尿素氮的影響

運動過程中機體蛋白質和氨基酸分解，含氮物質在體內堆積，小鼠BUN含量升高。由表4可知，基酒組小鼠的血清尿素氮含量顯著低于空白組（P＜0.05），低劑量組、中劑量組以及高劑量組小鼠的血清尿素氮含量均極顯著低于基酒組（P＜0.01）。說明酒精會減慢尿素氮在血液中的代謝分解速率，而復方金釵石斛保健酒可以加快尿素氮的代謝從而降低小鼠運動后體內的尿素氮含量。

表4 復方金釵石斛保健酒對小鼠血清尿素氮的影響Table 4 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the blood urea nitrogen of mice

2.5 復方金釵石斛保健酒對小鼠肝糖原的影響

肝糖原為機體可以利用的糖儲存，糖原儲存水平直接影響運動耐力水平。由表5可知，五組小鼠肝糖原含量差異不顯著（P＞0.05），說明復方金釵石斛保健酒不能通過增加小鼠肝糖原的儲存達到緩解體力疲勞的效果。

表5 復方金釵石斛保健酒對小鼠肝糖原的影響Table 5 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the hepatic glycogen of mice

2.6 復方金釵石斛保健酒對小鼠肝、腎組織的影響

由圖1A～圖1E可知，小鼠肝小葉結構正常，肝索排列整齊，呈放射狀?？瞻捉M、低劑量組、中劑量組、高劑量組的肝細胞大小一致，核呈圓形，核仁清晰，可見肝細胞漿粉染，無腫脹和空泡，匯管區無炎細胞浸潤，細胞核明顯，細胞之間邊界清晰。而溶媒組出現輕微細胞空泡現象。由圖1F～圖1J可知，腎皮質髓質分界清晰，腎被膜未增厚，腎小球結構正常，未見增生萎縮或纖維化，腎小管上皮細胞呈立方形，細胞排列緊密，管腔未見異常管。其中基酒組腎臟切片，均有不同程度的中性粒細胞炎性浸潤。以上結果表明酒精對腎組織有損傷作用，而復方金釵石斛保健酒對肝、腎無損傷作用。

圖1 復方金釵石斛保健酒對小鼠肝、腎組織的影響Fig.1 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on pathological section of liver and kidney tissue in different dose groups

2.7 討論

復方金釵石斛保健酒運用傳統中醫藥理論配伍組方，兼顧了滋陰和補氣兩大抗疲勞治法。組方中金釵石斛一直以來是中醫藥用于治療“虛損羸弱”的常用藥材，因其明確獨特的功效，近年來被廣泛研究，但藥理活性主要集中在抗腫瘤和降血糖等方面[14]，關于金釵石斛緩解體力疲勞的研究報道較少，梁鈞淞等[15]提取金釵石斛中的堿溶性多糖，發現提取物能夠通過提高血糖和甘油三酯含量、增加脂肪利用并延緩乳酸和氨積累等功效機理達到緩解體力疲勞的效果。組方其他四味藥材在不同程度上均有一定的緩解體力疲勞活性[16-19]。復方金釵石斛保健酒作為復合醇提物，緩解體力疲勞的藥理活性非五種藥材的機理相疊加，多種成分互相作用改變了各自原有的緩解體力疲勞作用途徑，甚至可能會產生毒副作用[20]。因此本研究對小鼠進行了負重游泳實驗以及血乳酸、血清尿素氮、肝糖原三個相關生化指標的檢測，以達到闡明復方金釵石斛保健酒對小鼠緩解體力疲勞機理的目的；同時對肝、腎組織進行病理學檢查，觀察復方金釵石斛保健酒對肝、腎這兩個主要代謝組織是否有毒副作用。

長時間重復的體力勞動會導致疲勞，引起一系列內分泌系統改變，運動耐力的下降是疲勞最主觀的表現形式和最客觀的指標[21]，因此負重游泳實驗是評價小鼠緩解體力疲勞能力最好的模型。在本次研究中，中劑量的復方金釵石斛保健酒能延長小鼠游泳時間（P＜0.05）。為了更進一步研究復方金釵石斛保健酒對小鼠的抗疲勞機理，測定了幾種疲勞生化指標說明作用途徑。劇烈運動時機體相對缺氧，糖酵解加快，產生大量乳酸，使肌肉中H+濃度上升pH值下降，乳酸大量堆積后，會降低肌肉反應度，使肌肉負荷和運動能力大大降低，產生疲勞感[22-23]。因此，加快乳酸分解或減少其產生都能緩解疲勞，BLA水平能反應疲勞程度。較長時間運動后，機體蛋白質與氨基酸分解代謝加強，血尿素氮明顯增加，身體對負荷的適應性減弱，產生的尿素氮增加，BUN含量能反應機體負荷能力[24]。糖是肌肉活動時能量的主要來源，長時間的運動，體力和糖原的耗竭會同時發生[25]，糖原的含量高低能說明疲勞的深淺程度。實驗發現，中、高劑量的復方金釵石斛保健酒能夠減少運動后堆積在小鼠體內的BLA（P＜0.01）；低、中、高劑量的復方金釵石斛保健酒能減少小鼠血清中的BUN堆積（P＜0.01）；肝糖原水平未發生變化。這說明在負重游泳實驗中，耐力的增強和減少BLA、BUN的堆積這兩種機理有關，而非通過提高糖原儲存來達到緩解體力疲勞效果。

數據表明，小鼠運動后基酒組BUN含量高于空白對照組（P＜0.05），這說明酒精的損傷作用，導致機體不能及時清除BUN，使身體負荷能力變差。為了進一步探究酒精作用機理，對小鼠的肝和腎進行HE染色切片觀察。結果顯示空白組和三個劑量組小鼠肝、腎組織未發生病變?；平M的肝細胞的輕微空泡可能為脂肪肝，機體長期攝入乙醇，乙醇脫氫酶使乙醇脫氫氧化，此過程影響三羧酸循環從而導致脂肪代謝減弱，脂肪堆積于肝中形成脂肪肝，在病理切片中體現為細胞空泡。腎組織有炎性浸潤，基酒中的醇類屬于水溶性外源物質，進入體內后除部分被胃吸收，容易在腎臟細胞和間質內沉積，對腎造成腫脹、損傷、炎癥反應等不同程度的損害，造成機體氧化應激產生炎癥反應[26]。復方金釵石斛中的成分與基酒中不易被吸收的物質締合，削弱了純基酒對肝、腎的損傷，與純基酒對比復方金釵石斛保健酒對肝腎的毒副作用不明顯。

3 結論

通過動物實驗對小鼠緩解體力疲勞活性進行考察，結果表明復方金釵石斛保健酒對體重不產生明顯影響。中劑量（16.7 mL/kg）復方金釵石斛保健酒能顯著增加小鼠游泳時間（P＜0.05），給予中（16.7 mL/kg）、高劑量（33.4 mL/kg）復方金釵石斛保健酒能極顯著降低運動后小鼠BLA水平（P＜0.01）。低（8.4mL/kg）、中（16.7mL/kg）、高劑量（33.4mL/kg）可極顯著降低運動后小鼠BUN含量（P＜0.01），但復方金釵石斛保健酒不能通過改變小鼠肝糖原緩解體力疲勞（P＞0.05）。各劑量組肝和腎細胞完整清晰，均未受損傷。根據《保健食品檢驗與評價技術規范》，負重游泳結果為陽性，且血乳酸、血清尿素和肝糖原三項生化指標中任意兩項為陽性，可判定復方金釵石斛保健酒具有緩解小鼠體力疲勞的功效，研究結果為開發安全有效的緩解體力疲勞保健食品提供了參考。