含水量和添加劑對黃梁木葉青貯發酵品質的影響

郭香，陳德奎，陳娜，李云，陳曉陽*，張慶*

（1.華南農業大學林學與風景園林學院，廣東木本飼料工程技術研究中心，廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室，廣東廣州510642；2.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州510642；3.北京林業大學生物科學與技術學院，北京100083）

黃梁木（Neolamarckia cadamba）原名團花（Anthocephalus chinensis），為茜草科（Rubiaceae）半落葉常綠高大喬木，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區。它的特點是蛋白質含量高，增長快，產量大，在良好的環境下，可以在10年內實現全面增長，因此，它有“奇跡樹”和“寶石樹”的稱號。黃梁木通常含有一些抗營養成分，如單寧、皂苷、多酚，這些成分會干擾胰蛋白酶和糜蛋白酶等消化酶的功能。為了最大限度地提高黃梁木的營養質量并獲得更廣泛的接受，這些抗營養因子可以通過青貯得到有效控制。青貯是一種傳統的牧草和谷物保鮮方法，旨在為家畜提供全年可得的營養適口的飼料。纖維素酶（cellulase，C）在青貯期間的應用被認為是一種直接促進纖維降解以釋放可發酵底物供乳酸菌使用的方法［1］，并通過降低pH來改善發酵質量。同時，植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum，LP）作為一種有效的促進劑，可以促進乳酸發酵［2］。此外，乳酸菌接種劑和纖維素酶的聯合使用對青貯質量顯示出協同效應［3］。青貯原料本身的含水量會影響發酵過程和青貯品質，王成等［4］研究表明，70%含水量對辣木（Moringa oleifera）葉的青貯發酵品質有明顯的改善作用。盡管已經進行了大量研究乳酸菌和纖維素酶對玉米（Zea mays）、牧草和全株青貯的影響，但有關黃梁木葉青貯的研究很少，并且含水量對黃梁木葉青貯的影響尚不清楚。在此基礎上，研究了使用植物乳桿菌和纖維素酶對不同含水量的黃梁木葉青貯的微生物種群、發酵品質、纖維和蛋白質組分以及單寧含量的影響，以期為黃梁木葉的青貯調制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃梁木種植于華南農業大學躍進試驗田（北緯23°19′，東經113°34′），人工采集黃梁木葉片。乳酸菌（LP）是從辣木青貯中篩選出來的，并根據Zhang等［3］的生理生化試驗和16S-rRNA測序方法進行了鑒定，將乳酸菌細胞與脫脂牛奶混合，冷凍干燥，制備的乳酸菌粉末在使用前對乳酸菌數量進行了計數。纖維素酶來源于里氏木霉（Trichoderma reesei），具有不低于10000 U·g-（1pH 5.5，37℃）的羧甲基纖維素酶活性，以及一定的β-葡聚糖酶和淀粉酶活性（湖南盛東生物科技有限公司，湖南岳陽）。

1.2 試驗設計

采用雙因素完全隨機設計，2×4（含水量×添加劑）因子處理結構。因素一為含水量，分兩個水平，75%（W1），60%（W2）；因素二為添加劑，添加6.00 log10cfu·g-1鮮樣（fresh matter，FM）植物乳桿菌（LP）、120 U·g-1FM纖維素酶（C）、6.00 log10cfu·g-1FM植物乳桿菌和120 U·g-1FM纖維素酶（LP×C）、不添加為對照組（CK）。2019年7月，將采集后的新鮮黃梁木葉片用手持干草切割機切成2~3 cm左右的長度，將添加劑溶解在10 mL蒸餾水中，用微型噴霧器噴灑在葉片上，對照組噴灑10 mL蒸餾水。混合均勻后裝入聚乙烯塑料袋（20 cm×30 cm），用食品真空封口機封口。每個處理6袋，室溫（約30℃）貯藏60 d（2個含水量×4個處理×6個重復，共48袋）。發酵60 d后，每兩袋混合取樣，原料和青貯樣品一式兩份采用相同試驗方法對發酵質量、微生物種群和化學成分進行分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵質量和微生物種群的評價 樣品（20 g）用蒸餾水（180 mL）在攪拌機中攪拌1 min，然后用4層紗布及定性濾紙過濾得到的濾液測定p H值（PHS-3C，上海雷磁）［5］。浸提液經0.22μm孔徑的濾膜過濾得到濾液，采用島津GC-14型高效液相色譜儀（Shodex Rspak KC-811s-DVB gel column色譜柱，SPD-M 10AVP檢測器，日本）測定了乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）和丙酸（propionic acid，PA）含量，流動相為3 mmol·L-1HClO4，流速為1.0 mL·min-1；柱溫箱50℃；檢測波長為210 nm；進樣量為5μL［6］。把黃梁木青貯料混合均勻之后稱重取樣放入65℃恒溫烘箱中48 h，計算烘干前后的重量比值得出干物質（dry matter，DM）。采用蒽酮比色法測定水溶性碳水化合物（water-soluble carbohydrate，WSC）：制作葡萄糖標準曲線，將樣品煮沸10 min，冷卻過濾定容，經吸取搖勻后加入蒽酮，在620 nm波長下比色測定吸光度計算可得。每個樣品20 g用180 mL無菌生理鹽水混合均勻逐級稀釋，利用平板計數法進行微生物數量的測定，用MRS（DeMan Rogosa Sharpe）瓊脂培養基和結晶紫中性紅膽鹽瓊脂在30℃培養2 d后對乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）和大腸桿菌（coliform bacteria，CB）計數，用孟加拉紅培養基在28℃培養3~5 d后對酵母菌和霉菌進行計數［7］。

1.3.2 化學成分分析 使用全自動凱氏定氮儀（K-9860，中國北京）對樣品進行總氮分析，總氮乘以因子6.25計算粗蛋白（crude protein，CP）［8］含量。氨態氮（ammonia nitrogen，NH3-N）、游離氨基酸（free amino acid，FAA）的測定按Broderick等［9］的方法進行。按照Licitra等［10］的方法測定蛋白質組成，包括非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）和真蛋白（true protein，TP）。使用范氏纖維法測定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量［11］。按照Harinder［12］的Folin-Ciocalteu比色法測定總酚（total phenol，TP）、簡單酚（simple phenol，SP）和水解單寧（hydrolysable tannin，HT）含量，其中水解單寧由總酚減去簡單酚可得，按照Coblentz等［13］的方法測定縮合單寧（condensed tannin，CT）含量。

1.4 數據統計與分析

微生物含量計數（乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌和霉菌）換算成log10，結果以鮮重表示。采用SPSS 19.0進行了雙因素方差分析，兩個因素互作顯著時用鄧肯極差法進行多重比較，其中以P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 青貯前黃梁木葉的特性

鮮黃梁木葉干物質含量約為27.69%（表1），粗蛋白含量約12.48%DM，水溶性碳水化合物含量低至4.49%DM，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維分別為30.84%DM和21.66%DM。菌群方面，附生乳酸菌、酵母菌和大腸桿菌分別為4.48、4.19和5.59 log10cfu·g-1FM，未檢出霉菌。總酚和簡單酚含量分別為5.62%DM和1.15%DM，水解單寧和縮合單寧含量分別為4.47%DM和1.72%DM。

表1 青貯前黃梁木葉的特性Table 1 The characteristic of the pre-ensiled N.cadamba leaves

2.2 黃梁木葉青貯的微生物特性和發酵品質

乳酸是主要的發酵產物（表2）。60%含水量處理的干物質含量，pH值和乳酸菌數量顯著升高（P<0.05），顯著（P<0.05）降低了乙酸的含量。添加LP和LP+C顯著降低了60%含水量處理的pH值（P<0.05），但其乳酸含量顯著（P<0.05）高于對照。60%含水量處理下添加LP酵母菌數量顯著降低（P<0.05），添加LP+C的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維都顯著降低（P<0.05）。然而，在所有青貯樣品中的丙酸都低于可檢測的水平，大腸桿菌數量小于2.00 log10cfu·g-1FM。方差分析結果表明，不同含水量處理對干物質、pH值、乳酸菌、酵母菌、乳酸、乙酸等有極顯著影響（P<0.01），對中性洗滌纖維有顯著影響（P<0.05），添加劑對各個指標（干物質、大腸桿菌、乙酸、丙酸除外）均有極顯著影響（P<0.01），二者的交互作用對乳酸有極顯著影響（P<0.01），對乙酸有顯著影響（P<0.05）。

表2 含水量和添加劑對青貯60 d后黃梁木葉的發酵品質和微生物群落的影響Table 2 Effect of moisture and additives on fermentation characteristics and microbial populations of N.cadamba leaves silage after 60 days ensiling

2.3 黃梁木葉青貯的單寧含量

黃梁木葉青貯60 d后（表3），添加LP+C下75%含水量的總酚、簡單酚、水解單寧和縮合單寧含量均顯著（P<0.05）低于60%含水量處理。方差分析結果表明，含水量處理對總酚、簡單酚、水解單寧和縮合單寧含量有極顯著影響（P<0.01），添加劑和兩者的交互作用僅對縮合單寧含量有顯著影響（P<0.05），即添加C和LP+C下75%含水量處理的縮合單寧含量顯著（P<0.05）低于60%含水量處理，添加LP和LP+C顯著（P<0.05）降低了75%含水量處理的縮合單寧含量。

表3 含水量和添加劑對青貯60 d后黃梁木葉的單寧含量的影響Table 3 Effect of moisture and additives on tannin contents of N.cadamba leaves silage after 60 days ensiling

2.4 黃梁木葉青貯的氮組分

添加C和LP+C顯著（P<0.05）提高了75%含水量處理的粗蛋白含量（表4），與75%含水量處理相比，60%含水量處理下僅添加LP和C顯著（P<0.05）提高了氨態氮含量。LP和LP+C提高了75%含水量處理的真蛋白含量，也降低了60%含水量處理的非蛋白氮含量，但差異不顯著。方差分析結果表明，含水量處理對氨態氮有極顯著影響（P<0.01）；添加劑對粗蛋白有極顯著影響（P<0.01），對真蛋白和游離氨基酸有顯著影響（P<0.05）；二者的交互作用對游離氨基酸有顯著影響（P<0.05）。

表4 含水量和添加劑對青貯60 d后黃梁木葉的氮組分的影響Table 4 Effect of moistur e and additives on nitrogen fr actions of N.cadamba leaves silage after 60 days ensiling

3 討論

鮮黃梁木葉的乳酸菌數量低于5.00 log10cfu·g-1FM。因此，添加乳酸菌接種劑可能有助于提高黃梁木葉青貯的發酵質量。此外，黃梁木葉的水溶性碳水化合物含量較低，僅為4.49%DM，通過添加從作物中釋放額外糖分的纖維素酶提高青貯中水溶性碳水化合物含量，進而提高青貯發酵品質［14］。

青貯60 d后，75%和60%含水量處理黃梁木葉干物質含量分別為23.59%和38.99%。含水量處理組對p H值、乳酸菌和酵母菌計數、乳酸、乙酸含量均有極顯著影響。當飼料水分太低時，將會直接抑制微生物發酵，而且由于空氣難以排凈，易引起霉變；然而，當水分過高時，由于腐敗微生物的存在，腐敗問題變得嚴重，青貯的最適含水量取決于原料和微生物接種量。在本研究中，75%含水量處理下p H值、酵母菌數量顯著降低，乳酸、乙酸等有機酸含量顯著升高。本研究結果表明，75%含水量條件下進行青貯可能是黃梁木葉貯存的有效途徑。

pH值是評價青貯發酵程度和青貯品質的重要參數。在本研究中，所有處理的pH值均小于4.2，表現出較好的青貯品質，這是因為大多數腐敗微生物通常在p H<4.2時被抑制。添加LP和LP+C可顯著降低p H值，這可能是因為在青貯階段添加乳酸菌接種劑，確保了快速而有力的發酵，從而加快了乳酸的積累，降低了青貯早期階段的pH值，并改善了牧草保存［15］。這也可以解釋添加LP和LP+C顯著增加乳酸含量的原因。此外，添加C和LP+C顯著降低了中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量，纖維素酶的添加使纖維含量得到有效降低。乳酸菌接種劑對水溶性碳水化合物含量高的青貯牧草更有效［16］，說明應用纖維素酶提高黃梁木葉青貯中的水溶性碳水化合物含量有利于青貯品質的改善。因此，植物乳桿菌與纖維素酶配合使用，對提高黃梁木葉青貯品質有進一步的積極作用。

單寧是木本植物原料中的一種抗營養因子，主要表現為減少動物攝食量，降低營養物質的生物利用率，并產生毒性效應［17］。相反，單寧對動物的生長也具有多種生理活性，如止血、抑制微生物、抗過敏、抗突變和抗衰老［18］。本研究結果表明，青貯60 d后75%含水量處理組與黃梁木原料相比水解單寧和縮合單寧的含量分別降低了73%和41%，并且添加了LP和LP+C之后75%含水量處理組的縮合單寧含量顯著降低，但是對總酚、簡單酚和水解單寧含量無明顯影響，添加LP+C的75%含水量處理的總酚、簡單酚、水解單寧和縮合單寧相比于60%含水量處理顯著降低，這可能是由于青貯飼料可能通過影響微生物的增殖而誘導更多的單寧酶分泌［19］，進而降低單寧含量。董文成等［20］研究表明，當牧草縮合單寧高于5.0%DM時，畜禽采食量下降，瘤胃發酵受到抑制，顯著降低了包括蛋白質在內的幾乎所有養分消化率。一般來說，不高于1.5%DM的單寧對豬和肉雞生長無不良影響［21］。青貯60 d后所有處理的縮合單寧都低于1.2%DM，在安全水平以下，不影響適口性和消化率。

本試驗所用黃梁木原料的粗蛋白含量相對較高，約為12.48%，與黃梁木葉青貯之后差異不大，符合我國二級飼料質量標準，可作為高蛋白飼料利用。在本研究中，含水量和添加劑對蛋白質的降解沒有影響，說明在青貯過程中，黃梁木葉具有較好的蛋白質保存能力，這可能與其葉片中含有豐富的酚類物質有關。多酚能夠與蛋白質結合，形成多酚-蛋白質復合物，從而減少植物材料分解過程中氮的釋放［22］。Jones等［23］還提供了多酚氧化酶可能參與紅三葉（Trifolium pratense）青貯期間蛋白質保護機制的證據。

相比于黃梁木，還有很多類似的熱帶、亞熱帶青貯飼料正在開發中，例如辣木、甘蔗（Saccharum officinarum）、香蕉（Musa nana）莖葉等，針對目前青貯飼料的供應不足，應多關注其他潛在的熱帶、亞熱帶青貯飼料。龐家滿等［24］利用辣木葉飼喂生長豬，研究發現辣木葉具有較高的營養價值，適合作為生長豬的蛋白質飼料原料。

4 結論

75%含水量處理通過增加乳酸含量，降低p H值、單寧含量，對青貯品質有一定的改善作用。添加纖維素酶可降低中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，添加植物乳桿菌通過降低青貯飼料的pH值、酵母菌數，提高乳酸和粗蛋白含量來改善青貯品質，并與纖維素酶聯合使用效果進一步增強。這些添加劑對單寧含量和氮組分影響不大，在青貯過程中，黃梁木葉蛋白質幾乎沒有降解。本研究結果表明，青貯在75%含水量時的黃梁木葉更有利于青貯品質的提高，但其最適含水量的確定還有待進一步研究。添加劑對青貯品質也有一定的改善作用，植物乳桿菌與纖維素酶配合使用效果較好，但其效果尚需進一步試驗證實。