添加單寧酸對青貯葛藤有氧穩定性和霉菌毒素含量的影響

楊冬梅，李俊年，陶雙倫

（吉首大學生物資源與環境科學學院，湖南吉首416000）

葛藤（Pueraria lobata）為蝶形花科葛藤屬，是多年生藤本植物。葛藤再生能力強，枝繁葉茂，每年藤蔓可伸長10 m以上，每年可刈割3~4次，葛藤鮮草產量5萬~6萬kg·hm-2。葛藤莖葉中粗蛋白含量為20.89%~29.20%［1-2］。同時，葛藤中所含葛根素、黃酮、甙元等生物活性物質，可提高動物機體免疫力，具有促進性腺、生殖功能、副性器官的發育和第二性征出現的作用，能緩解和防治由應激原引起的應激綜合癥［3］。我國西南地區各省均在大力推廣種植葛藤，生產葛粉，附加產生的大量葛藤莖葉，是牛羊的最佳飼料［4-5］。但西南地區氣候潮濕，晾曬的牧草易發霉變質，進行葛藤莖葉青貯是解決其發霉變質的有效途徑［6］。加之葛藤莖葉含水量大、蛋白質含量高且碳水化合物含量低，這些特性易導致青貯葛藤發酵期間的養分流失，降低青貯品質［4，6］。因此，選擇適宜的青貯添加劑提高葛藤青貯發酵品質顯得尤其重要。

單寧酸（tannic acid，TA）是具有還原性和抗氧化性的有機酸，具有殺菌、防腐、凝固蛋白質的作用［7-8］。在青貯飼料中添加單寧酸可迅速降低青貯飼料p H值，抑制雜菌的繁殖，降低氨態氮和總酸的含量，從而改善青貯飼料的品質［9-10］。單寧酸在動物消化道內部可與植物蛋白形成復合物，提高反芻動物過瘤胃蛋白，從而提高飼料中養分的可利用率［11-13］。同時，諸多研究也已表明，單寧酸能抑制小白鼠表皮與大腸多環芳香烴的誘變作用和腫瘤增生的作用，降低血脂清除自由基，將其應用于青貯過程中，以替代對人體健康具有潛在威脅的CH2O和CH2O2［14］，有助于生產綠色健康的有機畜產品。

青貯時添加單寧酸能降低p H，改善青貯品質，被應用于苜蓿（Medicago sativa）、象草（Pennisetum purpureum）、黑麥草（Lolium perenne）等青貯調制［15-18］。迄今，單寧酸應用于葛藤莖葉青貯中的報道較少，僅楊冬梅等［19］將3%和4%單寧酸添加在青綠葛藤莖葉中，青貯60d后添加單寧酸的葛藤莖葉青貯飼料質地松散完整，具有酸香味，干物質損失率顯著降低；可溶性碳水化合物和中性洗滌纖維含量顯著增加，但未深入檢測單寧酸對青貯葛藤莖葉品質及安全性的影響。本研究擬探討不同濃度單寧酸對青貯葛藤莖葉發酵品質、有氧穩定性及霉菌毒素含量的影響，為西南山區葛藤莖葉的科學利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 青貯原料

新鮮葛藤莖葉采自湖南湘西土家族苗族自治州古丈縣斷龍鄉楊家寨。采樣區海拔800~1200 m，地理坐標為東經109°10′-110°22.5′，北緯27°44.5′-29°38′。采樣區氣候屬亞熱帶季風濕潤氣候區，年平均氣溫15.0~16.9℃，最高氣溫40.5℃，最低氣溫-5.5℃。年降水量1300~1500 mm，無霜期250~280 d。年平均相對濕度77%，平均日照1397.2 h。

1.2 青貯制作

葛藤收獲后立即運往吉首大學生態研究所。將葛藤切割成2 cm左右小段，將水分含量調至60%~70%，以手握切碎的青貯料，手指縫中略有水為青貯料含水適中，沒有水為過干，適當勻撒些水，水分過多的通過晾曬達到水分適當。

添加單寧酸的比例參照李茂等［17］和楊冬梅等［19］的方法，并結合以前的預試驗。其中，單寧酸的添加濃度分別為0、1.0%、1.5%、2.0%（4個處理，處理組編號分別為對照組，1.0%TA，1.5%TA，2.0%TA），然后裝入塑料袋，每袋凈重500 g，每個處理15袋。用真空包裝機抽空塑料袋中的空氣，隨即密封并存放在干燥的室內。

1.3 樣品采集

青貯第5、10、35、50和70天分別采集樣品，按照4分法采集，一部分（100 g）青貯葛藤樣品直接保存于-80℃，用于霉菌毒素含量的測定；另一部分（25 g）加180 mL蒸餾水，榨汁機攪拌搗碎后用2層紗布和定性濾紙過濾得浸出液，所得浸出液一份于-80℃保存，用于發酵品質的測定，另一份進行10-1~10-7梯度稀釋，采用平板計數法測定微生物的數量。在添加放線菌酮（200μg·mL-1）的MRS肉湯培養基（蛋白胨10.0 g·L-1，肉膏10.0 g·L-1，酵母提取物5.0 g·L-1，葡萄糖20.0 g·L-1，磷酸氫二鉀2.0 g·L-1，檸檬酸氫二銨2.0 g·L-1，乙酸鈉5.0 g·L-1，硫酸鎂0.58 g·L-1，硫酸錳0.25 g·L-1，半胱氨酸0.5 g·L-1，吐溫80 1.0 g·L-1）中檢測乳酸菌數量，再在滅菌酒石酸調pH至3.5的馬鈴薯瓊脂培養基中檢測酵母菌數量。乳酸菌MRS瓊脂平板在37℃厭氧條件下培養24~48 h，酵母菌馬鈴薯瓊脂平板在37℃下培養48~72 h。

1.4 有氧穩定性

青貯50 d后，從每個青貯袋中取30 g樣品放入干凈的80 mL青貯瓶中，覆蓋2層紗布，在室溫下保存。取出的樣品在0，5及10 d進行一次取樣（10 g），測定p H，分析乳酸含量以及酵母菌的數量。有氧穩定性采用p H等指標進行分析，每個樣品3個重復。

1.5 樣品分析

參照張麗英［20］的方法測定樣品營養成分。采用烘干法測定干物質（dry matter，DM）含量；采用凱氏定氮法測定粗蛋白（crude protein，CP）含量［21］；采用ANKOM 220纖維分析儀（ANKOM，美國）測定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量［22］；參照余汝華等［23］的方法測定可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）含量；采用苯酚-次氯酸鈉比色法［24］測定氨態氮（NH3-N）含量。用雷磁PHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）測定pH值。采用島津LC-20A型高效液相色譜儀測定乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）含量，重復3次。

用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定樣品中黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）、嘔吐毒素（vomitoxin，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）含量，重復3次，試劑盒購自上海逸峰生物科技有限公司。

1.6 統計分析

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，采用單因子和雙因子方差分析（青貯時間×單寧酸添加量，有氧暴露時間×單寧酸添加量）進行處理組間差異比較，并采用Duncan氏法進行多重比較，數據用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

隨著青貯時間的延長，青貯葛藤莖葉粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量均有所下降（表1），但差異不顯著（P>0.05），可溶性碳水化合物含量顯著降低（P<0.05），青貯時間和單寧酸添加量對可溶性碳水化合物含量具有顯著的交互作用（P<0.05）。葛藤莖葉青貯50 d后，在2.0%單寧酸處理條件下可溶性碳水化合物含量和中性洗滌纖維含量較對照組顯著增加（P<0.05），粗蛋白含量雖有所增加，但差異不顯著。葛藤莖葉青貯70 d后，添加2.0%單寧酸的可溶性碳水化合物含量較對照組提高16%（P<0.05）。

表1 添加單寧酸對青貯葛藤莖葉營養成分的影響Table 1 Effect of tannin acid addition on the nutrient content of silage kudzu vine

葛藤莖葉青貯50 d后，添加單寧酸對青貯葛藤莖葉中乙酸含量、氨態氮含量、乳酸菌數量均無顯著影響（P>0.05）。單寧酸處理組未檢出丙酸和丁酸。而隨著葛藤莖葉青貯單寧酸添加量的增加，乳酸含量顯著下降（P<0.05）。各處理組酵母菌數量均低于2.00 lg CFU·g-1FM（表2）。

表2 添加單寧酸對青貯葛藤莖葉發酵參數的影響Table 2 Effects of addition of tannic acid on fermentation par ameters of silage kudzu vine

隨著青貯時間的延長，青貯葛藤莖葉中黃曲霉毒素、嘔吐毒素以及玉米赤霉烯酮含量均顯著降低（P<0.05），單寧酸能顯著降低黃曲霉毒素、嘔吐毒素以及玉米赤霉烯酮含量。青貯時間和單寧酸添加量對3種毒素的含量具有顯著的降低作用（表3）。

在青貯第35天，2.0%TA組青貯葛藤莖葉中黃曲霉毒素含量較對照組降低23.7%，嘔吐毒素含量較對照組降低57.3%，玉米赤霉烯酮含量較對照組下降30.0%；青貯第50天，2.0%TA組黃曲霉毒素含量較對照組降低79.3%，嘔吐毒素含量較對照組降低54.4%，玉米赤霉烯酮含量較對照組下降23.2%；青貯第70天，2.0%TA組黃曲霉毒素含量較對照組降低47.6%，嘔吐毒素含量較對照組下降53.9%，玉米赤霉烯酮含量較對照組降低37.4%（表3）。

表3 添加單寧酸對青貯葛藤霉菌毒素含量的影響Table 3 Effects of tannin acid addition on mycotoxin contents of silage kudzu vine（μg·kg-1）

在青貯葛藤莖葉開封第10天時，對照組p H顯著高于第0天；各處理組p H值略有升高，但各處理組間無顯著差異（P>0.05）（表4）。在青貯葛藤莖葉開封第10天時，對照組p H較開封第0天升高104.0%，1.0%TA組p H值較開封第0天升高65.6%，1.5%TA組較開封第0天p H值升高52.6%，2.0%TA組p H值較開封第0天升高19.0%。單寧酸處理組乳酸降幅顯著低于對照組（P<0.05），2.0%TA組酵母菌數量最低（P<0.05）。因此，2.0%TA組的p H值最低，乳酸降幅較小，酵母菌增加幅度較低，有氧穩定性最佳。有氧暴露時間對添加單寧酸的青貯葛藤莖葉p H（P<0.05）、乳酸含量（P<0.05）及酵母菌數量（P<0.05）具有極顯著影響。

表4 添加單寧酸對青貯葛藤有氧暴露過程中p H、乳酸含量和酵母菌數量的影響Table 4 Effects of addition of tannic acid on p H，lactic acid and yeast counts in silage kudzu vine

3 討論

青貯過程中葛藤莖葉借助微生物的發酵，形成大量的乳酸和揮發性脂肪酸，使pH低于4.2，抑制了所有微生物的活動，從而有效保存青貯飼料的蛋白質等營養物質。本研究發現在葛藤莖葉青貯中添加單寧酸能有效降低可溶性碳水化合物、中性洗滌纖維和蛋白質的損失，在青貯70 d后，添加2.0%單寧酸的青貯葛藤莖葉中可溶性碳水化合物含量較對照升高15%。前人對黑麥草［8］、苜蓿［12］、葛藤［19］和木薯葉［17］添加單寧酸增加了青貯飼料的DM、CP含量，本研究結果與此相近。單寧酸能迅速降低青貯葛藤莖葉飼料的p H，不僅抑制其他雜菌的繁殖，同時也抑制了葛藤自身的代謝。同時，單寧酸蛋白質結合形成難以水解的絡合物，降低蛋白質在瘤胃中的降解率，顯著增加青貯飼料過瘤胃蛋白，從而提高反芻動物對飼料蛋白質的利用率［10］，提高動物生產性能和機體體質。這為我國西南山區草食畜牧業發展提供了新的途徑。

評價青貯飼料發酵品質的一個重要指標為有機酸，乳酸占有機酸總量比值越大，丁酸占比值越小，青貯飼料品質越好［25-27］。本研究發現葛藤莖葉添加單寧酸青貯后，青貯葛藤乳酸含量顯著下降，且沒有檢測出丙酸和丁酸，與Salawu等［9］、楊冬梅等［19］報道的結果相似。說明添加單寧酸可使青貯葛藤莖葉p H迅速降低，從而進一步抑制各種微生物的生長，有效阻遏了青貯飼料養分的丟失。這可能是單寧酸與蛋白質絡合抑制了微生物的繁殖，降低了它們對青貯飼料營養成分的利用，特別是對蛋白質的分解利用。

青貯飼料有氧穩定性一直以來都是國內外學者關注的熱點［28］。青貯飼料有氧變質可導致營養物質損失、霉變、毒素蓄積，酵母菌是引起該過程的主要微生物［29-31］。本研究中青貯葛藤莖葉開封后，2.0%TA組的pH值最低，乳酸含量降幅較小，酵母菌數量增加幅度較低，有氧穩定性高。單寧酸能夠改善有氧穩定性，主要是抑制酵母菌、霉菌的活性，降低其對青貯葛藤莖葉養分的消耗和有毒物質的形成。此外，單寧酸處理組乳酸含量較高，在一定程度上也抑制了酵母菌和霉菌的生長，延長了青貯飼料在有氧條件下的穩定性。

霉菌毒素可通過飼料進入動物體內，導致動物中毒或者生產性能下降，積聚在動物體內或動物產品（蛋奶等）中，從而降低動物產品品質，甚至引發消費者急性或慢性中毒［32］。霉菌毒素是霉菌等雜菌在被污染的作物上代謝形成的有毒代謝產物［33］。本研究顯示單寧酸能顯著降低青貯葛藤莖葉中黃曲霉毒素、嘔吐毒素以及玉米赤霉烯酮的含量，隨著青貯飼料發酵時間的延長，3種毒素的含量也逐漸降低。對照組在有氧發酵階段，霉菌大量繁殖產生霉菌毒素，當pH進一步下降到乳酸菌成為優勢菌群時，霉菌活動受限，霉菌毒素產量逐漸減少。在青貯葛藤中添加單寧酸，不僅使青貯葛藤莖葉p H值下降，而且單寧酸可與霉菌體內的蛋白酶結合，致使胞內蛋白質變性，無法進行正常新陳代謝而死亡，從而達到抑制細菌滋生的效果。湘西地區氣候潮濕，干草易于滋生霉菌形成霉菌毒素，不利于葛藤晾制干草。將青綠葛藤莖葉青貯，不僅可充分利用當地豐富的葛藤莖葉資源，同時可解決冬季牛羊牧草不足的問題。

4 結論

在青貯葛藤莖葉中加入適量單寧酸，對青貯葛藤莖葉的品質具有提高作用，可取代甲酸、甲醛等對人及家畜有危害的青貯飼料添加劑，可有效抑制不良微生物活性，提高青貯葛藤莖葉品質，為西南山區草食畜牧業的發展提供新的途徑。