不同乙肝病毒DNA載量的慢性乙型肝炎患者外周血中Th17/Treg表達及意義

陳麗龍 向尹 陳小娟 陳俊良 劉楷

慢性乙型肝炎(chronic active hepaititis B，CHB)可經血液、母嬰等方式傳播，近年來CHB發生率逐年升高[1]。乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)-DNA載量是評估CHB患者機體HBV活性的有效指標，HBV-DNA載量高說明HBV活性較強，傳染性高，且可能會加重肝細胞損傷[2]。既往臨床檢測HBV-DNA載量多采用熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)、競爭PCR等技術，此類方式雖可明確HBV-DNA載量情況，但檢測時容易受其他因素干擾，且檢測要求嚴格，不利于基層醫院推廣[3]。因此，需尋求可能與CHB患者HBV-DNA載量有關的血清學指標，輔助評估患者高HBV-DNA載量風險。研究指出，CHB的發生、發展與適應性免疫存在密切關系，機體免疫功能異常是導致HBV感染慢性化及肝損傷加重的重要原因之一[4]。輔助性T細胞-17(hlper T cell-17，Th-17)、調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)是維持機體免疫重要細胞，其中Th-17可輔助調節炎性反應及免疫應答，而Treg可抑制T細胞效應及炎性反應[5]。胡萍等[6]研究證實Th-17、Treg與GHB發病存在密切聯系，且可能會推進疾病發展。鑒于此，本研究通過探討不同HBV-DNA載量的CHB患者外周血中Th17/Treg表達及臨床意義，重點分析Th17/Treg表達與CHB患者HBV-DNA載量的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻納入樂山市人民醫院檢驗科檢測的217例CHB患者為研究對象，男113例，女104例；年齡28～47歲，平均年齡(37.75±2.31)歲；體重指數(body mass index，BMI)17.2～24.7 kg/m2，平均(20.99±1.04)kg/m2；病程6～14個月，平均(10.33±1.22)個月。

1.2 入選標準 (1)納入標準：①CHB符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[7]中相關標準；②在我院接受相關治療，且可獲得檢測標本；③免疫系統正常；④精神正常，可配合研究。(2)排除標準：①合并甲型、丙型等其他類型肝炎；②合并肝癌或肝衰竭；③合并心肌炎、腎衰竭等其他臟器疾病；④接受抗病毒治療；⑤哺乳或妊娠期患者。

1.3 方法

1.3.1 HBV-DNA載量檢測及分組:采取患者入院時空腹狀態下外周靜脈血5 ml，離心 3 000 r/10 min，取血清進行乙肝DNA提取。180 μl乙肝DNA裂解液+80 μl血清+3 μl內標，充分震蕩混勻瞬離后，金屬浴加熱，100℃ 10 min，隨后用低溫高速離心機進行離心。取上層清液20UL加入反應體系，進行PCR擴增反應(中山大學達安基因股份有限公司提供的乙肝DNA檢測試劑盒)。先在93℃環境下預變性2 min，然后分別在93℃環境下反應45 s、55℃環境下反應60 s，共10個循環、93℃環境下反應30 s、55℃環境下反應45 s，共30個循環，最后采用全自動實時熒光定量PCR儀(宏石公司，型號：SLAN- 96P)測定HBV-DNA載量。根據HBV-DNA載量檢測結果，將CHB患者分為低HBV-DNA載量組(<500 copies/ml)、中HBV-DNA載量組(500～1 000 copies/ml)、高HBV-DNA載量組(>1 000 copies/ml)。

1.3.2 外周血Th17、Treg檢測:取患者入院時空腹狀態下外周靜脈血5 ml，用密度梯度離心法提出外周中單個核細胞；選取1×106個細胞標本，依次滴加佛波酯50 ng/ml、離子霉素1 μg/ml，并將標本置于1640培養基(含有高爾基蛋白轉換抑制劑)中；待刺激5 h后，對標本進行離心、固定、染色處理，然后用流式細胞儀(BD公司，型號：BD FACS canto PLUS)測定外周血Th17、Treg表達，并計算Th17/Treg；檢測試劑及試劑盒均購自BD公司。

1.3.3 主要肝纖維化指標檢測:取患者入院時空腹狀態下外周靜脈血5 ml，以4 000 r/min轉速離心10 min，使用血清用全自動生化分析儀(日立LABOSPECT，型號：008)測定谷氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。

2 結果

2.1 CHB患者HBV-DNA載量情況及相關基線資料比較 217例CHB患者中低HBV-DNA載量64例，占29.49%(64/217)，中HBV-DNA載量118例，占54.38%(118/217)，高HBV-DNA載量35例，占16.13%(35/217)。3組間性別比、年齡、BMI等基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同HBV-DNA 載量CHB 患者相關基線資料比較

2.2 不同HBV-DNA載量CHB患者相關實驗室指標比較 高HBV-DNA載量組ALT、AST、Th17、Treg、Th17/Treg水平均高于中HBV-DNA載量組、低HBV-DNA載量組，且中HBV-DNA載量組ALT、AST、Th17、Treg、Th17/Treg水平高于低HBV-DNA載量組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同HBV-DNA 載量CHB 患者相關實驗室指標比較

2.3 各主要變量與CHB患者HBV-DNA載量的關系分析 經Spearman相關性分析檢驗，CHB患者HBV-DNA載量與Th17/Treg、ALT、AST均呈正相關(r>0，P<0.05)，Th17/Treg分別與ALT、AST呈正相關(r>0，P<0.05)。見表3。

表3 各主要變量與CHB 患者HBV-DNA 載量的關系分析結果

3 討論

HBV作為嗜肝DNA病毒，入侵機體后會結合肝細胞膜，損傷肝細胞，且可能會引發機體免疫應答，加重肝細胞損傷[8]。據報道，HBV感染引起的CHB，隨著病情的進展容易出現肝纖維化，且可能會增加肝癌發生風險，威脅患者生命安全[9]。因此，尋求HBV-DNA載量相關血清指標，對輔助評估CHB患者HBV活性，指導早期干預尤為重要。

據報道，CHB患者HBV-DNA載量與肝纖維化程度存在一定關系，隨著HBV-DNA載量的增加，肝纖維化程度加重[18]。ALT、AST是評估肝纖維化程度重要指標，二者高表達提示肝功能損傷嚴重[19]。本研究通過初步比較不同HBV-DNA載CHB患者ALT、AST表達，后經Spearman相關性分析檢驗結果顯示，CHB患者HBV-DNA載量與ALT、AST均呈正相關。同時發現，Th17/Treg與ALT、AST也呈正相關，說明隨著Th17/Treg的升高，ALT、AST水平上升，即肝纖維化風險增加或程度加重。分析原因在于，Th17/Treg失衡可能會減弱對HBV復制抵抗作用，從而導致HBV快速復制，加重肝細胞損傷，繼而增加肝纖維化風險或加重已經發生肝纖維化患者的干纖維化程度[20]。但本研究并未探討Th17/Treg預測CHB患者肝纖維化風險價值，研究結果存有局限，未來仍需展開大樣本量、前瞻性研究加以驗證。

綜上所述，CHB患者HBV-DNA載量與外周血Th17/Treg呈正相關，且肝纖維化的發展也可能與Th17/Treg失衡有關，考慮未來可檢測患者入院時Th17/Treg，輔助評估患者病情與肝纖維化情況，可能對遏制疾病進展有積極意義。