miR-141介導(dǎo)NF-κB信號通路對卵巢癌紫杉醇敏感性的影響及機(jī)制研究

洪琴 王治潔 陸杲川 李旭紅 林嵐 王丹

卵巢癌是女性癌癥死亡的第五大原因，也是婦科癌癥死亡的主要原因[1]。由于卵巢癌早期相關(guān)的癥狀不明顯，超過70%的病例被診斷出時已為晚期轉(zhuǎn)移階段，且5年生存率約為30%[2]。卵巢癌的主要治療方法是手術(shù)切除可見腫瘤，隨后進(jìn)行化療輔助，如紫杉醇和順鉑等藥物[3]。多數(shù)卵巢癌患者對紫杉醇產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致復(fù)發(fā)，然而紫杉醇耐藥的分子機(jī)制目前尚不完全清楚。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，通過抑制靶基因mRNA穩(wěn)定性或翻譯實(shí)現(xiàn)多種生物學(xué)功能[4]。越來越多的證據(jù)表明異常表達(dá)的miRNA在化療藥物抵抗性或藥物敏感性中發(fā)揮重要作用[5,6]。最近在卵巢癌細(xì)胞中紫杉醇抗性相關(guān)差異miRNA中發(fā)現(xiàn)miR-141，提示miR-141參與卵巢癌細(xì)胞的紫杉醇敏感性[7]。研究表明，NF-κB信號通路的激活參與多種化療藥物如紫杉醇、長春新堿、多柔比星等耐藥過程[8]。據(jù)報道，miR-141的下調(diào)通過激活前列腺癌中的NF-κB信號傳導(dǎo)促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移[9]，提示miR-141可能介導(dǎo)NF-κB信號通路的激活發(fā)揮功能。本實(shí)驗(yàn)探討miR-141是否介導(dǎo)NF-κB信號通路影響卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性，以期為卵巢癌的紫杉醇耐藥性機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞庫)；紫杉醇注射液(北京康平源醫(yī)藥有限公司)；PRIM-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT(美國Sigma公司)；FITC-AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；miR-141抑制物及無關(guān)序列(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；Lipofectamine 2000(美國Invitogen公司)；NF-κB信號通路特異性抑制劑QNZ(美國Selleck Chemicals公司)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；p-P65抗體、p-IκBα抗體、P65抗體、IκBα抗體及二抗(美國CST公司)；PVDF膜(美國Abcam公司)；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人卵巢癌細(xì)胞SKOV3培養(yǎng)于含10%胎牛血清的PRIM-1640培養(yǎng)基中，放置在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞貼壁生長匯合度達(dá)>80%時，以胰蛋白酶消化傳代，取處于對數(shù)生長期的SKOV3接種于6孔板中，分別將0、10、50、100、500、1 000 ng/ml紫杉醇注射液添加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為，anti-miR-141組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-141抑制物，NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，Blank組細(xì)胞不做轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染操作參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞。

1.3 熒光定量PCR檢測各組卵巢癌SKOV3細(xì)胞中miR-141的表達(dá)水平 分別收集轉(zhuǎn)染48 h后Blank組、NC組和anti-miR-141組SKOV3細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以實(shí)時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。分析溶解曲線和熔煉曲線，得出Ct值，采用2-ΔΔCt法計算各組SKOV3細(xì)胞中miR-141相對表達(dá)水平。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測各組卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖能力 分別將Blank組、NC組和anti-miR-141組SKOV3細(xì)胞接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時，在每孔細(xì)胞中添加濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，再在每孔細(xì)胞中加入二甲基亞砜150 μl，于震蕩儀上振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上，選擇570 nm波長測定每孔細(xì)胞OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計算各組細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=(1-試驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測嗎啡對細(xì)胞凋亡的影響 收集上述各組SKOV3細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，離心，收集約1×106個細(xì)胞，以結(jié)合緩沖液100 μl重懸細(xì)胞，加入5 μl FITC-AnnexinⅤ混勻，再加入5 μl PI染液混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測，統(tǒng)計各組細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot檢測各組SKOV3細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平 選擇100 ng/ml的紫杉醇干預(yù)Blank組、NC組和anti-miR-141組SKOV3細(xì)胞，同時使用NF-κB信號通路特異性抑制劑QNZ干預(yù)anti-miR-141組SKOV3細(xì)胞，分別加入蛋白裂解液提取各組細(xì)胞中總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白樣品上樣，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉1 h后，加入一抗4℃雜交過夜，p-P65一抗1∶500稀釋，p-IκBα一抗1∶500稀釋，P65一抗1∶800稀釋，IκBα一抗1∶800稀釋，PBST洗滌3次后，加入1∶3 000稀釋的二抗室溫雜交2 h。PBST洗滌3次后，采用ECL化學(xué)發(fā)光，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件對各條帶灰度值進(jìn)行分析，計算目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.7 NF-κB信號通路抑制劑對SKOV3細(xì)胞對紫杉醇敏的感性的影響 選擇100 ng/ml的紫杉醇和NF-κB信號通路特異性抑制劑QNZ同時干預(yù)anti-miR-141組SKOV3細(xì)胞，MTT法檢測SKOV3細(xì)胞增殖抑制率，方法同1.4。流式細(xì)胞儀檢測SKOV3細(xì)胞凋亡率，方法同1.5。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，2組間差異比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析，2組差異比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-141抑制物對miR-141表達(dá)水平的影響 將miR-141抑制物轉(zhuǎn)染至人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中，與Blank組和NC組比較，anti-miR-141組SKOV3細(xì)胞中miR-141表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Blank組與NC組比較，miR-141表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明在卵巢癌SKOV3中轉(zhuǎn)染miR-141抑制物能夠抑制miR-141的表達(dá)。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染48 h 后qRT-PCR 檢測3 組SKOV3細(xì)胞中miR-141 表達(dá)水平

2.2 抑制SKOV3細(xì)胞中miR-141的表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的影響 MTT實(shí)驗(yàn)檢測3組細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示，與Blank組和NC組比較，anti-miR-141組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Blank組與NC組比較增殖抑制率改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Blank組、NC組和anti-miR-141組細(xì)胞半數(shù)抑制濃度分為為169.84 ng/ml、186.21 ng/ml和69.42 ng/ml，anti-miR-141組細(xì)胞半數(shù)抑制濃度顯著低于Blank組和NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明抑制miR-141的表達(dá)能夠增加SKOV3細(xì)胞對紫杉醇的敏感性。見表2。

表2 不同濃度紫杉醇處理對3 組SKOV3 細(xì)胞增殖抑制率影響

2.3 NF-κB信號通路抑制劑對NF-κB信號通路激活的影響 在轉(zhuǎn)染的同時使用NF-κB信號通路特異性抑制劑QNZ處理anti-miR-141組細(xì)胞，Western blot檢測3組SKOV3細(xì)胞中NF-κB信號通路相關(guān)因子的表達(dá)水平，與Blank組和NC組比較，anti-miR-141組細(xì)胞中p-P65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與anti-miR-141組比較，anti-miR-141+QNZ細(xì)胞中p-P65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Blank組與NC組比，p-P65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4組細(xì)胞中總蛋白P65和IκBα表達(dá)水平不變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示抑制miR-141的表達(dá)能夠下調(diào)p-P65和p-IκBα蛋白表達(dá)，抑制NF-κB信號通路的活化。NF-κB信號通路特異性抑制劑QNZ能夠進(jìn)一步阻斷NF-κB信號通路的激活。見圖1，表3。

圖1 Western blot檢測3組細(xì)胞中p-P65、P65、p-IκBα和IκBα蛋白水平

表3 3 組卵巢癌SKOV3 細(xì)胞中p-P65 、P65 、p-IκBα 和IκBα 蛋白水平比較

2.4 抑制miR-141的表達(dá)促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞凋亡 使用終濃度為100 ng/ml的紫杉醇分別處理3組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測3組細(xì)胞凋亡率，與Blank組和NC組比較，anti-miR-141組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Blank組與NC組比較，凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示抑制miR-141的表達(dá)能夠促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞凋亡。見圖2，表4。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測3組細(xì)胞凋亡率

表4 3 組卵巢癌SKOV3 細(xì)胞凋亡率比較

2.5 NF-κB信號通路抑制劑增強(qiáng)SKOV3細(xì)胞對紫杉醇敏的感性 使用NF-κB信號通路特異性抑制劑QNZ阻斷NF-κB信號通路后，MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率，與anti-miR-141組比較，anti-miR-141+QNZ組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(t=6.060，P<0.05)，凋亡率增加(t=5.221，P<0.05)。提示QNZ進(jìn)一步增強(qiáng)了SKOV3細(xì)胞對紫杉醇敏的感性，說明miR-141介導(dǎo)NF-κB信號通路影響SKOV3細(xì)胞對紫杉醇敏的感性。見圖3，表5。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組SKOV3細(xì)胞凋亡率

表5 3 組卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率比較

3 討論

乳腺癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[10]。手術(shù)聯(lián)合化療是目前治療乳腺癌的主要方式，紫杉醇是最常用的治療卵巢癌的化療藥物之一，然而阻礙乳腺癌治療的主要障礙是耐藥的產(chǎn)生。因此，通過增強(qiáng)化療藥物敏感性是改善乳腺癌患者治療效果的重要途徑。miRNA是約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，人類原發(fā)性癌癥中miRNA的表達(dá)改變已被用于腫瘤診斷、分類、分期和預(yù)后[11,12]。此外，miRNA控制細(xì)胞生長、增殖、代謝和凋亡，目前研究顯示miRNA在各種類型癌癥中的耐藥性中具有重要作用。據(jù)報道，miR-141是一種廣泛研究的人類miRNA，與多種癌癥中的癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)[13,14]，最近有證據(jù)表明miR-141也與癌癥中的耐藥性相關(guān)。Imanaka等[15]強(qiáng)調(diào)了miR-141在食管鱗狀細(xì)胞癌順鉑耐藥發(fā)展中的重要調(diào)節(jié)作用。此外，miR-141介導(dǎo)的KEAP1調(diào)節(jié)在卵巢癌細(xì)胞對順鉑的細(xì)胞反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[16]。此外，下調(diào)的miR-141參與胃癌中幽門螺桿菌調(diào)節(jié)的順鉑敏感性[17]。盡管已經(jīng)對miR-141進(jìn)行了深入研究，但關(guān)于miR-141在乳腺癌中紫杉醇敏感性機(jī)制研究仍較匱乏。在本研究中，通過在人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-141抑制物，抑制miR-141的表達(dá)，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，抑制miR-141的表達(dá)能夠顯著抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)SKOV3細(xì)胞對紫杉醇的敏感性。

雖然有幾項研究確定了miR-141在化療耐藥中的作用，但miR-141誘導(dǎo)的化療耐藥的潛在機(jī)制目前尚不清楚。大多數(shù)miRNA通過抑制靶基因的有效mRNA翻譯起作用，其可能參與癌癥和化療抗性的進(jìn)展[18,19]。先前的研究表明，可以通過KEAP1調(diào)節(jié)的NF-κB途徑在miR-141過表達(dá)后被激活，并且該途徑的抑制部分逆轉(zhuǎn)了miR-141介導(dǎo)的卵巢癌順鉑耐藥性[18]。越來越多的證據(jù)表明NF-κB信號通路與癌癥的化療抗性相關(guān)。目前已經(jīng)證明紫杉醇誘導(dǎo)組成型NF-κB活化并導(dǎo)致人癌細(xì)胞的化學(xué)抗性[20]。藥物或其他因子通過抑制NF-κB信號通路的激活增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性[21]。本實(shí)驗(yàn)中抑制miR-141的表達(dá)后，SKOV3細(xì)胞中NF-κB信號通路相關(guān)因子p-P65和p-IκBα蛋白水平顯著降低，提示NF-κB信號通路活化受到抑制。提示抑制miR-141的表達(dá)可能通過抑制NF-κB信號通路的激活增強(qiáng)SKOV3細(xì)胞對紫杉醇的敏感性。為驗(yàn)證該推測，本實(shí)驗(yàn)在抑制miR-141的表達(dá)的SKOV3細(xì)胞同時以NF-κB信號通路特異性抑制劑QNZ處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，QNZ能夠增強(qiáng)下調(diào)miR-141誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制，促進(jìn)下調(diào)miR-141誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)了SKOV3細(xì)胞對紫杉醇的敏感性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-141介導(dǎo)NF-κB信號通路影響卵巢癌SKOV3細(xì)胞對紫杉醇的敏感性。

綜上，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了下調(diào)miR-141的表達(dá)能夠增強(qiáng)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞對紫杉醇的敏感性，其作用機(jī)制可能涉及NF-κB信號通路的活化，提示miR-141可能作為卵巢癌患者對紫杉醇耐藥性治療的潛在靶點(diǎn)，為進(jìn)一步體內(nèi)及臨床研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。