頸項(xiàng)透明層厚度增厚胎兒應(yīng)用染色體微陣列技術(shù)效果分析及其臨床意義

劉 敏 曾 靜 曾 云 吳麗芳

1.廣東省惠州市第二婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣東惠州 516008；2.廣東省惠州市第二婦幼保健院超聲科，廣東惠州 516008；3.廣東省惠州市第二婦幼保健院分子實(shí)驗(yàn)室，廣東惠州 516008

頸項(xiàng)透明層（nuchal translucency，NT）是妊娠11～13+6周時(shí)超聲下顯示的胎兒頸后部皮下的液體生理性積聚，是胎兒非整倍體染色體畸形的敏感性指標(biāo)[1]。目前臨床傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)僅能檢出非整倍體染色體數(shù)目及較大片段（＞10 Mb）的結(jié)構(gòu)異常，在核型分析顯示正常的NT增厚胎兒中，仍有少部分胎兒出現(xiàn)各種結(jié)構(gòu)畸形和遺傳綜合征等不良預(yù)后[2]。染色體微陣列技術(shù)（chromosome microarray analysis，CMA）相比傳統(tǒng)核型分析具有分辨率高，能檢出＞100 kb的拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNVs）的優(yōu)勢(shì)[3]。本研究旨在探討CMA檢測(cè)在NT增厚胎兒中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年9月至2020年8月惠州市第二婦幼保健院妊娠早期行超聲篩查顯示NT≥2.5 mm胎兒203例，均行介入性產(chǎn)前診斷（絨毛/羊水取材術(shù)），獲取胎兒標(biāo)本，同時(shí)行染色體核型分析及CMA檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①孕11～13+6周；②單胎妊娠；③均進(jìn)行遺傳咨詢并簽署知情同意書，排除夫妻雙方本身合并染色體異常疾病。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。依據(jù)文獻(xiàn)[4]對(duì)孕11～13+6周早孕期胎兒超聲篩查進(jìn)行規(guī)范化操作及儲(chǔ)存圖像，測(cè)量胎兒NT值3次以上，記錄NT最大值，以NT≥2.5 mm定義為異常增厚，并按照不同胎兒NT厚度分為四組，2.5～2.9 mm組、3.0～3.9 mm組、4.0～4.9 mm組及≥5.0 mm組。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 樣本采集 對(duì)NT增厚的胎兒在超聲儀（三星麥迪有限公司，型號(hào)：WS80A）引導(dǎo)下進(jìn)行胎兒組織物取材術(shù)，并將胎兒組織標(biāo)本，放置于4℃冰箱中保存待檢。

1.2.2 DNA提取 取得胎兒組織物標(biāo)本后，經(jīng)規(guī)范處理，使用全基因組DNA提取試劑盒（廣州碩恒生物科技有限公司，品牌：Qiagen，生產(chǎn)批號(hào)：163011552）提取DNA，紫外分光度計(jì)（NanoDrop公司，型號(hào)：ND-1000）測(cè)定所提取DNA的濃度和純度。

1.2.3 染色體核型分析 取胎兒樣本，離心出干凈的絨毛標(biāo)本，接種于培養(yǎng)基瓶中常規(guī)培養(yǎng)觀察，收獲標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)制片，80℃烤6 h，采用G顯帶，顯微鏡下觀察30個(gè)中期分裂相，兩線鏡下各分析5個(gè)染色體核型，嵌合體以加倍計(jì)數(shù)分析。

1.2.4 CMA檢測(cè) 根據(jù)提供的基因芯片（Affymetrix公司，型號(hào)：CYTOSCAN 750k）標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作流程對(duì)所提取的全基因組DNA進(jìn)行處理。具體操作流程是基因組DNA酶切消化、連接、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增、純化定量分析、片段化、標(biāo)記，芯片雜交、洗滌、染色與掃描芯片。根據(jù)CMA檢測(cè)結(jié)果參考常用國際公共數(shù)據(jù)庫，如基因變異的數(shù)據(jù)庫（Database of Genomic Variants，DGV）及本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫，對(duì)CNVs的性質(zhì)進(jìn)行判斷。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

觀察傳統(tǒng)染色體核型分析及CMA檢測(cè)NT增厚胎兒合并結(jié)構(gòu)畸形類型及其檢出率的差異性，并比較不同NT值分組間采用CMA檢測(cè)致病性CNVs病例均數(shù)。檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)以下情況時(shí)均可判斷為致病性CNVs：該CNVs片段與DECIPHER數(shù)據(jù)庫中已知的微缺失/微重復(fù)綜合征區(qū)域相重疊；該片段遺傳自有相同表型的親代；臨床意義不明確的CNVs（variant s of uncertain significance，VOUS）：已知國際在線數(shù)據(jù)庫（如DGV，DECIPHER，ISCA等）中未找到重疊片段；片段內(nèi)含有功能尚不明確的基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析及CMA檢測(cè)結(jié)果比較

傳統(tǒng)核型分析檢出染色體異常70例（34.98%），CMA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)77例染色體異常，檢出率為37.93%，且額外檢出致病性CNVs共7例，見表1。

表1 染色體核型分析及CMA檢測(cè)結(jié)果比較（n=203）

2.2 不同NT值分組CMA檢測(cè)結(jié)果分析

2.5～2.9 mm組共檢出6例（16.22%）異常；3.0～3.9 mm組共檢出17例（22.67%）異常，其中2例致病性CNVs；4.0～4.9 mm組共檢出19例（40.43%）異常，其中2例致病性CNVs；≥5.0 mm組共檢出35例（79.55%）異常，其中1例致病性CNVs，2例為VOUS。另外，隨著NT值的增加，胎兒染色體異常發(fā)生率也隨之增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=47.322，P=0.000），見表 2。

表2 不同NT值分組CMA檢測(cè)結(jié)果分析

2.3 7例核型分析正常而CMA檢測(cè)異常結(jié)果分析

7例染色體核型正常的胎兒經(jīng)CMA檢測(cè)檢出的CNVs具有致病性，其中4例有微缺失綜合征，3例微重復(fù)綜合征，與傳統(tǒng)染色體核型分析檢測(cè)結(jié)果比較，CMA檢測(cè)的檢出率提高了3.45%（7/203），見表3。

表3 7例核型分析正常而CMA檢測(cè)異常結(jié)果分析

3 討論

染色體異常通常指染色體的數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常，是導(dǎo)致胎兒出生缺陷的主要原因，且其除了伴發(fā)多系統(tǒng)畸形外和智力障礙外，致殘率及致死率均高，給社會(huì)和家庭帶來了極大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5-6]。隨著臨床技術(shù)的研究發(fā)展，CMA因其具有提高染色體檢出率顯著優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷中，CMA對(duì)NT增厚但染色體正常的胎兒進(jìn)行CNVs判斷，所獲得具有臨床意義的染色體微缺失/微重復(fù)檢出率達(dá)7.7%～8.3%[7]。

本研究對(duì)孕早期NT增厚的胎兒進(jìn)行傳統(tǒng)的染色體核型分析，染色體異常的檢出率為34.98%，主要包括染色體數(shù)目異常及少部分結(jié)構(gòu)畸變等。但對(duì)NT增厚胎兒進(jìn)一步行CMA檢測(cè)，額外檢出7例致病性染色體異常。在核型分析顯示染色體正常的胎兒中，可能隱藏著亞顯微結(jié)構(gòu)的基因突變或基因CNVs，這往往與染色體微結(jié)構(gòu)異?；蜻z傳綜合征相關(guān)[8]。而CMA針對(duì)產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常的情況的檢測(cè)具有顯著診斷作用，其能夠檢測(cè)出傳統(tǒng)染色體核型分析無法檢測(cè)的CNVs和單親二倍體等[9]。關(guān)于NT值與胎兒CNVs的相關(guān)性，劉偉明[10]的研究顯示，隨著NT厚度的增加，CNVs發(fā)生率也隨之增高。在本研究中，不同NT值分組間CMA檢測(cè)染色體異常的發(fā)生率也明顯升高，因此認(rèn)為NT增厚胎兒與胎兒染色體異常的發(fā)生率呈明顯的正相關(guān)。此外，本研究通過CMA額外檢出7例染色體微缺失/微重復(fù)，其片段大小介于 0.256 ～3.181 Mb，其中6例為致病性CNV，2例為VOUS。在不同NT值組中，CMA的檢出率高于傳統(tǒng)核型分析的3.45%，主要由于CMA可檢測(cè)傳統(tǒng)核型分析難以識(shí)別的亞顯微結(jié)構(gòu)異常[11-12]。CMA作為最常用的臨床遺傳學(xué)診斷工具之一，在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用中，相比較于傳統(tǒng)的核型分析，其具有不可替代的重要性[13]。CMA的特點(diǎn)是在全基因組范圍內(nèi)高分辨檢測(cè)，尤其針對(duì)染色體的CNVs可進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)，可檢出傳統(tǒng)染色體核型分析所發(fā)現(xiàn)大部分異常及較小片段的微缺失/微重復(fù)，具有高分辨率、高通量、高自動(dòng)化檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)[14-15]。CMA技術(shù)在NT增厚的應(yīng)用中，能夠檢出更多具有臨床意義的致病性疾病，在產(chǎn)前診斷標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)中具有可行性的重要意義。

綜上，胎兒NT增厚與染色體異常密切相關(guān)，CMA技術(shù)能檢測(cè)傳統(tǒng)核型分析無法識(shí)別的染色體微缺失/微重復(fù)，提高染色體疾病的檢出率，為產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢指導(dǎo)提供依據(jù)。