黑緣煙蟋螽絲腺結構

竇玉潔, 趙會敏, 石福明, 常巖林

(河北大學生命科學學院, 河北保定 071002)

昆蟲唾液腺是開口于口前腔的多細胞腺體，依據其開口的位置，分為上顎腺、下顎腺和下唇腺(黃志君等, 2007)，以下唇腺最為普遍。對昆蟲唾液腺的研究，模式生物果蠅研究得相對較清楚(Berendes, 1965; Harrod and Kastritsis, 1972; Thomopoulos and Kastritsis, 1979; Thomopoulosetal., 1992)。直翅目中，沙漠蝗Schistocercagregaria的唾液腺為泡狀腺體，腺泡位于胸部兩側，導管末端開口于舌基部的唾竇。每個腺泡由壁細胞、酶原細胞、導管細胞、氣管母細胞、鞘細胞和色素細胞組成(Kendall, 1969)。飛蝗Locustamigratoria唾腺細胞超微結構顯示，細胞核很大，在腺泡中的分泌物排出后，腺泡空泡化，呈現出較多的粗面內質網和線粒體(甘雅玲和郭中偉, 2002)。對半翅目葉蟬Hishimonuslamellatus、長翅目的蝎蛉科、膜翅目小家蟻Monomoriumpharaonis、缺翅目昆蟲唾液腺的形態和結構也有一些報道(Maetal., 2011; Boonen and Billen, 2016; Dallaietal., 2017; Daietal., 2019)。

吐絲昆蟲的絲腺是由外胚層發育來的，有真皮腺來源的絲腺、馬氏管或附性腺來源的絲腺和下唇腺特化的絲腺(Sehnal and Akai,1990; 黃志君等, 2007)。下唇腺特化的絲腺主要集中在鱗翅目(Akai, 1971, 1984, 1986; Akaietal., 1993; Victoriano and Gregorio, 2002; Sorensenetal., 2006)和紡足目(Büsseetal., 2015, 2016)。紡足目和直翅目的蟋螽是僅有的幼期和成蟲期均具吐絲行為的類群(Scholtzetal., 2018)。蟋螽若蟲與成蟲均可吐絲，用絲把植物的葉片綴起來(對折)做成巢，其白天隱藏巢內，夜晚外出捕食、求偶和交配等，蟋螽若蟲在孵化后數天內開始筑巢，并且能夠準確識別自己的巢，蟋螽不同個體間巢的結構和絲的密度基本一致(Rentz and John, 1990; Lockwood and Rentz, 1996; Hale, 2000)。

目前，對蟋螽吐絲的研究僅局限于吐絲行為的觀察和絲腺外部形態的描述以及絲蛋白成分的分析(Walkeretal., 2012)，蟋螽的絲腺來源于唾液腺(下唇腺)(Sutherlandetal., 2010)，絲腺至少分泌2種蛋白——絲膠蛋白和絲心蛋白(Sehnal and Akai, 1990; Hale, 2000)。對于蟋螽絲腺的顯微和超微結構未見報道。本研究對蟋螽科黑緣煙蟋螽Capnogryllacrisnigromarginata(Lietal., 2014)成蟲絲腺的整體形態、顯微結構和超微結構進行了觀察，研究發現蟋螽絲腺分泌細胞分為Ⅰ型分泌細胞和Ⅱ型分泌細胞，并根據圍細胞的位置和形態結構，推測分泌物從分泌細胞向外運輸過程中，圍細胞微絨毛腔的微絲束對分泌物的外排提供推動力。

1 材料與方法

1.1 試蟲和腺體樣品

黑緣煙蟋螽雄性成蟲，于2019年6月20日采自廣東省乳源縣南嶺(24.93°N, 113.02°E)，成蟲活體帶回實驗室，單頭單籠短暫飼養。

解剖野外采集的黑緣煙蟋螽雄性成蟲，手捏前胸背板，剪去足，并從背部剪開，暴露出整個消化道，摘除消化道；沿舌基部的腺管向后，從胸部腹側內壁輕輕刮取，得到完整的腺體樣品。

1.2 解剖學觀察

將解剖分離的腺體用甲醇∶冰醋酸(3∶1)溶液固定15～20 min后，相機拍照。所用單反相機型號為Canon E0S 7D，微距鏡頭型號為Canon MACRO 100 mm。

1.3 蘇木精-伊紅(H.E.染色)染色觀察

將解剖分離的腺體置于Bouin’s固定液中固定24 h。70%, 85%, 95%和100%梯度酒精脫水，環保型脫蠟透明液透明，石蠟滲透包埋，石蠟切片機切片，粘附于載玻片上，切片厚度為6 μm。室溫下，根據標準流程進行常規的蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, H.E.)染色，Olympus BX51光學顯微鏡觀察拍照。

1.4 PAS-蘇木精染色觀察

將解剖分離的腺體置于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中，在4℃下固定48 h。然后在0.5 mol/L蔗糖中脫水，于-20℃下用O.C.T.包埋。用Leica CM1860冷凍切片機將包埋塊切成5 μm厚的冷凍切片，并粘附于載玻片上。室溫下，用高碘酸Schiff液(periodic acid Schiff, PAS)以及蘇木精染色，Olympus BX51光學顯微鏡觀察拍照。

1.5 激光共聚焦顯微鏡觀察

將解剖分離的腺體置于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中，在4℃下固定12～24 h。然后在0.5 mol/L蔗糖中脫水，于-20℃下用O.C.T.包埋。用Leica CM1860冷凍切片機將包埋塊切成5 μm厚的冰凍切片，并粘附于載玻片上。在室溫下，用1% Triton X-100將組織處理30 min。然后用5% BAS封閉處理1 h；接著用異硫氰酸標記的抗α-微管蛋白鼠單克隆抗體(anti-α-tubulin-FITC, mouse monoclonal, Sigma-Aldrich)1∶100稀釋，室溫下孵育1 h，PBS漂洗。再將組織用鬼筆環肽-羅丹明(phalloidin-tetram ethylrhodamine B isothiocyanate, Sigma-Aldrich)染色45 min，PBS漂洗。接著，用DAPI染色15 min，PBS漂洗。之后在FV3000激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.6 掃描電鏡觀察

將解剖分離的腺體迅速切割成小塊，置于2.5%戊二醛溶液中，4℃固定1 h，PB漂洗3次；轉至四氧化鋨溶液中，4℃固定2 h，PB漂洗3次；梯度酒精脫水后，丙酮置換。將樣品置于Leica EM CPD300全自動臨界點干燥儀干燥，用導電膠將樣品置于日立TM300臺式掃描電子顯微鏡樣品臺上觀察(加速電壓5 kV)，拍照。

1.7 透射電鏡觀察

將解剖分離的樣品迅速切割成1 mm3的小塊，置于2.5%戊二醛溶液中，4℃固定1 h，PB漂洗3次；轉至四氧化鋨溶液中，4℃固定2 h，PB漂洗3次；梯度酒精脫水后，相繼在丙酮/環氧樹脂Epon812(1∶1, v/v)和純環氧樹脂Epon812中滲透，再轉至環氧樹脂Epon812中于60℃下聚合包埋48 h。Reichert-Jung超薄切片機切片，1 μm半薄切片用甲苯胺藍染色定位，Olympus BX51光學顯微鏡觀察拍照。50 nm超薄切片用檸檬酸鉛和醋酸鈾雙染，JEM-100SX透射電子顯微鏡下觀察(加速電壓80 kV)，拍照。照片通過Adobe Photoshop CS(ps)軟件進行處理排版，使用畫圖軟件為CorelDRAW12。

2 結果

2.1 絲腺形態

黑緣煙蟋螽雄性成蟲(圖1: A)絲腺由絲腺導管和葡萄樣腺泡組成，腺泡附著于胸部腹板兩側，對稱分布，腺管的總導管從舌基部下方與下唇之間的唾竇發出，在離開唾竇不遠處分為左右2支，向后延伸至胸部，逐級分支變細，并與分布于胸部腹側的成簇的腺泡相連，腺體呈乳白色(圖1: B)。每個腺泡可能含有數個細胞群(圖1: C, D)。在掃描電鏡下觀察到腺泡表面凹凸不平，突起常為三角形，分支導管末端深入腺泡內部，腺泡周圍有許多微氣管伸入組織內部(圖1: D)，導管橫截面有縱向的紋路，外表面光滑(圖1: E)。

圖1 黑緣煙蟋螽雄性成蟲(A)與絲腺的解剖結構(B～E)

2.2 腺泡細胞結構

黑緣煙蟋螽絲腺腺泡外圍由鞘細胞伸長形成的結締組織鞘包圍(圖2: A, B)，鞘細胞的細胞核扁平且長，具有明顯的細胞核邊界。細胞質在細胞核周圍為一薄層，細胞質中細胞器較少，伸長的結締組織纖維是分層的(圖2: C)。

圖2 黑緣煙蟋螽絲腺腺泡的鞘細胞

絲腺腺泡內包含4種類型的細胞，Ⅰ型分泌細胞、Ⅱ型分泌細胞、圍細胞和腔細胞(圖3～6)。

分泌細胞又可以分為2類：Ⅰ型分泌細胞(圖3)和Ⅱ型分泌細胞(圖4)。Ⅰ型和Ⅱ型分泌細胞PAS染色呈不同顏色，Ⅰ型分泌細胞靠近腺泡中心，細胞質為紅色；Ⅱ型分泌細胞位于腺泡外圍，未被染成紅色。

腺泡內有2種運輸細胞：圍細胞(圖5)和腔細胞(圖6)。運輸細胞較分泌細胞小，細胞核明顯位于細胞一側。

2.2.1Ⅰ型分泌細胞：細胞靠近腺泡中心，細胞很大，形狀不規則，PAS染色為紅色，PAS染液與細胞內的多糖結合，因此推測S1分泌顆粒為糖蛋白顆粒(圖3: A)。甲苯胺藍染色顯示，細胞質中有大量的著色顆粒(圖3: B)。

細胞核大，圓形，直徑為11～13 μm，核孔明顯(圖3: C)。胞質內含大量的粗面內質網，內質網上附著有核糖體，胞質中游離核糖體較少，它們大多沿粗面內質網的膜排列。在電子顯微照片中，這些膜系統通常以松散的平行堆疊的形式出現，內質網排列規則(圖3: D, E)，細胞質內有大量的球形分泌顆粒，大小不一，分泌顆粒為均勻的電子致密顆粒(圖3: C, D)。

圖3 黑緣煙蟋螽絲腺腺泡的Ⅰ型分泌細胞

2.2.2Ⅱ型分泌細胞：一般位于Ⅰ型分泌細胞和圍細胞(或結締組織鞘)之間(圖4: A)，細胞很大，形狀不規則，PAS不能將其染為紅色(圖4: A)，甲苯胺藍染色顯示，細胞質著色淺，甲苯胺藍著色顆粒無或極少(圖3: B)。

細胞核圓形，直徑12～16 μm，核孔明顯，核仁位于細胞核近中央(圖4: B)。細胞質結構松散，胞質內散布短的排列不規則的滑面內質網，其間分布有大量圓形或橢圓形分泌顆粒。顆粒大小不一，內部可見螺旋片層結構，電鏡觀察結果電子致密程度不同，片層結構類指紋狀(圖4: C, D)。

圖4 黑緣煙蟋螽絲腺腺泡的Ⅱ型分泌細胞

2.2.3圍細胞：常成對排列，位于腺泡外層，與結締組織鞘接觸，三角形，寬基部靠近結締組織鞘，較尖端指向腺泡中心，插入分泌細胞之間。細胞核位于細胞寬基部，圓形，直徑10～12 μm，細胞質內具1微絨毛腔，微絨毛腔為錐形，微絨毛腔與細胞核大小相似，由細胞膜內陷形成(圖5: A～C)。微絨毛腔內充滿排列整齊的微絨毛(圖5: D, E, H)，細胞質內可見大量的線粒體(圖5: G)，常聚集于微絨毛腔周圍(圖5: H)。

鬼筆環肽-羅丹明熒光染色表明有成對存在的紅色環形，即微絨毛腔，微絨毛腔的細胞質一側以及細胞質基質被染成綠色(圖5: I～L)。由于鬼筆環肽特異性地與細胞中的微絲結合，因此推測微絨毛腔由密集微絲束支撐。異硫氰酸標記的抗α-微管蛋白抗體證明，圍細胞的細胞質中存在大量的微管蛋白。

2.2.4腔細胞：分布于分泌細胞之間(圖6)，細胞較小，形狀不規則，細胞核形狀不規則，占據細胞的大部分空間。腔細胞包圍1圓形的胞外空腔通道，細胞及細胞核形態與胞外通道相適應，腔細胞連接處為加厚的膜結構(圖6: F)，在未加厚的部位，分泌細胞向通道內延伸形成短的微絨毛結構，不同分泌細胞的分泌顆粒聚集在這些微絨毛周圍，向通道內分泌物質。

免疫熒光染色顯示，有微絨毛的部位呈現紅色，細胞外通道被異硫氰酸標記的抗α-微管蛋白抗體染成綠色，胞外通道內的微絨毛與圍細胞微絨毛腔的微絨毛均由微絲蛋白支撐(圖6: G～J)。

圖6 黑緣煙蟋螽絲腺腺泡的腔細胞

2.2.5圍細胞與腔細胞的連接：圍細胞的微絨毛腔向腺泡中心延伸，與腔細胞包圍的胞外通道相連(圖5: D)，在微絨毛和通道連接的空腔內看到小的電子致密顆粒和角質層的碎片，表明微絨毛腔為胞外空腔通道的末端(圖5: F)。

圖5 黑緣煙蟋螽絲腺腺泡的圍細胞

2.3 絲腺導管

絲腺導管連接唾竇和胸腔內腺泡，在蟋螽吐絲過程中起到運輸絲蛋白的作用。顯微觀察顯示絲腺的總導管和分支導管細胞在結構上無差別。

顯微結構顯示，導管橫切面為環形，由單層細胞構成，細胞核較大，位于細胞中央，管腔內側具明顯的突起，細胞質內具清晰的縱紋(圖7: A)。

透射電鏡下觀察導管細胞結構與腺細胞結構顯著不同。細胞質內未觀察到分泌物質，細胞外圍可觀察到顯著的規則排列的深的質膜內陷，延伸至細胞的約1/3處(圖7: B)，形成細胞質隔室，細胞質隔室內可觀察到大量的長的線粒體(圖7: C, D)。細胞核形狀不規則，位于細胞中央。細胞靠近管腔一側具一層連續的小的突起，排列整齊，在導管壁的表皮下緊密聚集(圖7: E)。

熒光染色觀察顯示，導管細胞外圍紅色染色較深(微絲)，細胞靠近管腔內側綠色染色較深(微管蛋白)(圖7: F～I)。

圖7 黑緣煙蟋螽絲腺導管

2.4 絲腺腺泡細胞結構模式

依據黑緣煙蟋螽絲腺腺泡顯微結構觀察結果(圖2～4)，結合其超微結構(圖2～6)，繪制了絲腺腺泡結構示意圖(圖8)：黑緣煙蟋螽絲腺泡外被鞘細胞形成的結締組織，腺泡的主體包含4種細胞，即Ⅰ型分泌細胞、Ⅱ型分泌細胞、腔細胞和圍細胞。分泌細胞大，細胞質內含有大量的內質網和分泌顆粒，Ⅰ型分泌細胞內含糖蛋白，超微結構顯示為均勻致密的圓形顆粒；Ⅱ型分泌細胞的分泌顆粒為螺旋片層結構，染色深淺不一，但不含糖蛋白。腺泡內的胞外通道由單個腔細胞包圍而成，腔細胞及細胞核形狀不規則，分泌顆粒常常聚集在胞外通道周圍。圍細胞成對存在于腺泡的外圍，呈三角形，細胞內具1由微絲束支撐的微絨毛腔。

圖8 黑緣煙蟋螽絲腺腺泡細胞結構示意圖

3 討論

3.1 黑緣煙蟋螽吐絲行為

大多數鱗翅目僅幼蟲具吐絲行為，蟋螽成蟲和若蟲均具有吐絲行為(Hale, 2000)。蟋螽吐絲時，將樹葉卷曲，用絲從內側綴起來形成巢穴，白天躲藏在內。在飼養蟋螽時，觀察到黑緣煙蟋螽用絲將樹葉卷曲成巢，當下唇接觸到葉片表面時，在葉片表面黏合一層片狀的絲，從片狀絲抽離之后形成纖維狀絲，再與另一側的葉片表面通過片狀絲相連，最終將樹葉縫合成一個巢穴狀的空間。

3.2 黑緣煙蟋螽絲腺來源于下唇腺，主要包含Ⅰ型和Ⅱ型分泌細胞

直翅目蝗蟲唾液腺開口于舌下方，在唾液管離開不遠處分為左右2支，皆通入胸部腹側，每支腺管連接葡萄叢狀的泡狀腺。腺泡由2種細胞組成：酶原細胞和壁細胞(Kendall, 1969; 郭郛等, 1991)。蟋螽絲腺顯微及超微結構觀察顯示出與直翅目唾液腺相似的結構，表明蟋螽絲腺與直翅目其他昆蟲的唾液腺同源，蟋螽的絲腺來源于下唇腺(Hale, 2000)，通過對絲腺形態和吐絲行為的觀察表明，黑緣煙蟋螽絲腺由連接著唾竇的導管和葡萄樣腺泡組成，腺泡用于分泌絲蛋白，腺管用于運輸絲蛋白。與前人的研究結果相同，本研究認為黑緣煙蟋螽絲腺來源于下唇腺。

對黑緣煙蟋螽絲腺顯微和超微結構的研究表明，絲腺腺泡外圍由鞘細胞伸長形成的結締組織鞘包圍，包含Ⅰ型分泌細胞、Ⅱ型分泌細胞、圍細胞和腔細胞4種細胞，分泌細胞起分泌作用，圍細胞和腔細胞運輸分泌物。PAS染色可以顯示細胞內糖的分布(Suetal., 2017)。本研究通過PAS染色將黑緣煙蟋螽絲腺分泌細胞分為Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型分泌細胞靠近腺泡中心，發生PAS反應，證明Ⅰ型分泌細胞含有糖蛋白成分；Ⅱ型分泌細胞在腺泡外周，位于Ⅰ型分泌細胞與圍細胞或結締組織鞘之間，沒有PAS反應(圖3: A; 圖4: A)，說明Ⅱ型分泌細胞內不包含糖類物質。

電鏡超微結構觀察也顯示，Ⅰ型分泌細胞和Ⅱ型分泌細胞分別分泌不同的顆粒，胞質內觀察到大量的內質網和分泌顆粒。圍細胞與鞘細胞接觸，腔細胞分散在分泌細胞之間。分泌細胞的蛋白分泌物超微結構觀察顯示有2種：1種為均質的球形分泌泡(Ⅰ型分泌細胞分泌)，PAS染色顯示為糖蛋白；1種為具螺旋片層結構的分泌泡(由Ⅱ型分泌細胞分泌)，形狀為圓形或橢圓形(圖3和4)。我們推測2種分泌物可能是絲的不同組成蛋白，對于2種物質的組成及其作用，還需進一步研究驗證。蟋螽的絲腺沒有用于儲存絲蛋白的腔，推測絲腺可能是根據需求來進行分泌的。

3.3 微絨毛推動黑緣煙蟋螽絲腺分泌物從分泌細胞向絲腺導管的運輸

在黑緣煙蟋螽絲腺導管和腺泡胞外通道中，未發現肌肉組織(圖5～7)。圍細胞細胞質中觀察到大量線粒體，腔細胞細胞質中未觀察到線粒體(圖5)，因此推測腔細胞無法向胞外提供物質運輸所需的大量能量。電鏡觀察結果顯示，圍細胞的微絨毛腔向腺泡中心延伸，與腔細胞包圍的胞外通道相連，在微絨毛和通道連接的空腔內看到小的電子致密顆粒和角質層的碎片(圖5)，表明腔細胞包圍的胞外通道的末端為圍細胞的微絨毛腔。熒光染色觀察結果證明微絨毛腔的微絨毛主要由微絲束支撐(圖5)。微絲參與許多細胞運動，如微絨毛的收縮、細胞的極化、胞內物質運輸、細胞運動和胞吞胞吐作用等，微管也常常參與胞內物質運輸、細胞器定位與遷移以及細胞運動等作用(Goodeetal., 2000; Lazaro-Dieguezetal., 2006; 邱鴻和于榮, 2009; Tang and Gerlach, 2017)。因此本研究推測，在分泌蛋白從分泌細胞向絲腺導管的運輸過程中，動力可能主要是由微絨毛腔的微絲束收縮擺動提供的。

之前對蟋螽絲腺的研究較少，綜合顯微和超微結構(圖8)以及形態、行為觀察，推測黑緣煙蟋螽絲蛋白分泌過程大致為：分泌細胞內具有大量的內質網和核糖體，使分泌細胞能夠合成大量的分泌顆粒；分泌細胞在與腔細胞包圍的胞外通道的接觸處，向通道內伸出短的微絨毛；由不同的分泌細胞合成的不同的分泌顆粒，分別聚集在分泌細胞與胞外通道連接處的微絨毛附近，分泌物質在此處從分泌顆粒的膜泡中排出，進入胞外通道；腔細胞包圍的胞外通道與絲腺的分支導管相連，分泌物質經腺泡內胞外通道進入分支導管，然后到達總導管；通過唾竇，排出體外，液態蛋白遇空氣最終形成固態的絲。即分泌物質在體內產生、分泌并釋放到體外的過程依次經過分泌細胞、腔細胞包圍的胞外通道、分支導管、總導管、唾竇。