美國白蛾熱激蛋白70基因的鑒定及功能分析

喬 恒, 李 慧, 耿薏舒, 趙旭東, 于曉航, 郝德君,*

(1.南京林業大學南方現代林業協同創新中心, 南京 210037; 2.南京林業大學林學院, 南京 210037)

美國白蛾Hyphantriacunea屬鱗翅目(Lepidoptera)燈蛾科(Arctiidae)，是一種寄主范圍廣、繁殖力強、適生性強、危害嚴重的世界性檢疫害蟲(季榮等, 2003)。自1979年首次在我國遼寧省丹東地區發現以來，至2019年已經擴散至北京、天津、河北、內蒙古、遼寧、吉林、江蘇、安徽、山東、湖北、河南、湖北、陜西共13個省(區、市)的近600個縣級行政區(國家林業和草原局2020年第3號公告)，對我國的林木資源及相關產業造成了巨大的經濟損失。

昆蟲在長期外界溫度脅迫下，進化出復雜而多樣的行為、生理生化及分子機制去抵御外界不利的溫度(Maetal., 2021)，其中熱激蛋白(heat shock protein, HSP)在昆蟲體內發揮著重要的作用。熱激蛋白又稱熱休克蛋白，是一種物種間和進化上均高度保守的蛋白質(王宇萍和蔣建東, 2010)。當生物體遭遇極端溫度、饑餓脅迫、氧化脅迫、重金屬脅迫時，會優先轉錄該蛋白，引導其他蛋白質的正確折疊，幫助生物體抵御不良環境(Zhao and Jones, 2012)。關于熱激蛋白的分類，不同的學者有不同的分類方式，但普遍采納根據蛋白分子量大小將HSP分為以下5個家族：HSP110, HSP90, HSP70, HSP60和sHSP(Watersetal., 1996)。其中HSP70作為熱激蛋白家族的重要組成部分，一直備受國內外關注。研究發現，熱激蛋白70家族主要包括誘導型熱激蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)和組成型熱激蛋白70(heat shock cognate protein 70, HSC70)兩種類型(Simoncellietal., 2010)。HSP70序列由N端保守的ATPase功能域及C端的底物結合功能域構成(Flahertyetal., 1990)。N端的ATPase功能域可水解ATP，C端的底物結合功能域可與未折疊的多肽底物暴露在外的疏水區域特異性相結合(Kangetal., 1990; Nelsonetal., 1992)。許多學者分別對煙草天蛾Manducasexta(Marinetal., 1994)、二化螟Chilosuppressalis(崔亞東等, 2010)、舞毒蛾Lymantriadispar(Whyardetal., 1986)、粉紋夜蛾Trichoplusiani(Seversonetal., 2005)和葉色草蛉Chrysopaphyllochroma(劉璐, 2014)等昆蟲的HSP70基因序列進行克隆，并發現其在抵御高溫脅迫中發揮重要作用。楊廣生等(2020)基于基因組數據，篩選了4條美國白蛾HSP70基因，并推測其中一條基因在水解ATP中發揮著重要作用，但未闡明HSP70基因在美國白蛾高溫脅迫響應中的功能。

在我國，美國白蛾呈現不斷向南擴散的趨勢，而在南方地區，夏季溫度常達35～40℃(中國天氣網http:∥www.weather.com.cn/)。由此可見，美國白蛾在擴散的過程中，不可避免地遭受高溫脅迫，而目前關于美國白蛾高溫脅迫響應的分子機制研究尚屬空白。因此，本研究以美國白蛾HSP70基因為研究對象，通過基因克隆、高溫脅迫下的表達特性分析、原核表達及純化及ATPase活性測定等技術，探究HSP70基因在美國白蛾高溫脅迫響應中的功能，為美國白蛾發生區域的預測預報及其他昆蟲HSP的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

美國白蛾幼蟲于2019年6月采自江蘇省淮安市楚州區古城墻遺址公園(33.62°N, 119.02°E)，帶回實驗室后利用人工飼料進行飼養，飼養條件為：溫度26±1℃，相對濕度65%±5%，光周期16L∶8D。成蟲羽化后，提供30%蜂蜜水。以室內飼養的第2代4齡幼蟲作為實驗用蟲。

選取新蛻皮的美國白蛾4齡第2天幼蟲，分別在25(對照), 30, 35和40℃下處理1, 2和3 h，每3頭幼蟲混合作為一個樣本，每個處理均進行3次生物學重復。所有的樣本均用1.5 mL的無核酶離心管保存，轉至液氮中速凍，再置于-80℃冰箱中保存用于后續RNA提取及相關實驗。

1.2 美國白蛾總RNA的提取和cDNA的合成

利用Trizol法提取1.1節中保存樣本的總RNA，通過微量紫外分光光度儀(NanoDrop ND-2000, Thermo, 美國)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質量和濃度。選擇凝膠電泳條帶清晰明亮且OD260/OD280值在1.8～2.0之間的mRNA樣品，按照反轉錄試劑盒HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase(Vazyme, 南京)的步驟，合成cDNA模板。

1.3 美國白蛾熱激蛋白70基因的克隆

基于美國白蛾轉錄組數據庫(本實驗室構建，未發表)，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物HSP70-F1/HSP70-R1和HSC70-F1/HSC70-R1(表1)，引物由南京金斯瑞生物公司合成。以1.2節中合成的美國白蛾4齡幼蟲cDNA為模板，利用LA Taq聚合酶(TaKaRa, 大連)進行PCR擴增。PCR反應體系(50 μL): dNTP Mix(2.5 mmol/L)8 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, Mg2+(25 mmol/L)5 μL, 上下游引物(10 pmol/L)各1 μL, cDNA模板(500 μg/μL)1 μL, LA Taq(5 U/μL)0.5 μL, ddH2O 28.5 μL。PCR反應條件: 95℃ 3 min; 98℃ 10 s, 50℃ 15 s, 72℃ 2 min，循環35次; 72℃ 10 min。PCR擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且通過DNA回收試劑盒(TIANGEN, 北京)純化，連接至T/A Blunt Vector載體后，導入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態細胞(Vazyme, 南京)，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂板上過夜培養，挑取陽性克隆于LB液體培養基中37℃ 200 r/min孵育2 h，再進行菌液PCR鑒定。將驗證正確的菌液送至杰李(上海)生物技術公司測序。

1.4 生物學信息學分析

利用分子生物學軟件DNAMAN8.0進行序列的對比和拼接，信號肽預測利用SignalP在線網站(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)，等電點及分子質量預測利用在線網站(https:∥web.expasy.org/protparam/)，蛋白三維結構預測利用在線網站SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)。利用在線工具NCBI(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索鱗翅目中已知昆蟲的熱激蛋白70基因序列，利用Clustalx軟件進行序列對比，同源搜索鱗翅目、鞘翅目、半翅目、膜翅目、雙翅目共5個目41種的HSP70和HSC70氨基酸序列，用MEGA 7.0軟件結合鄰接法(neighbor-joining method, NJ)進行1 000次抽樣分析來構建進化樹，并用在線軟件iTOL(https:∥itol.embl.de/)進行修飾。

1.5 qPCR檢測

本實驗選擇EF1α作為美國白蛾4齡幼蟲不同溫度處理下基因表達分析的內參基因(陶蓉等, 2019)，內參基因的擴增引物為EF1α-F/EF1α-R(表1)。根據1.3節中克隆獲得的HSP70基因序列，利用在線網站(https:∥www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool)設計并篩選qPCR引物HSP70-qF/HSP70-qR和HSC70-qF/HSC70-qR(表1)。qPCR反應在Applied Biosystem 7500 System(Thermo Fisher Scientific, 美國)上進行，反應體系(20 μL): SYBR Green Master Mix(YEASEN, 上海)10 μL, 上下游引物(10 pmol/L)各0.4 μL, cDNA模板2 μL, RNase-free H2O 7.2 μL。反應程序: 95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 60℃ 40 s，循環40次; 95℃ 15 s, 60℃ 60 s, 95℃ 15 s形成溶解曲線。每個樣品設置3個生物學重復及3個技術重復。

1.6 美國白蛾熱激蛋白70的重組表達與純化

利用CE Design軟件(Vazyme, 南京)設計美國白蛾熱激蛋白70基因序列的原核表達引物(HSP70-tPCR-F和HSP70-tPCR-R, 表1)，引物包含NheⅠ和BamHⅠ酶切位點。同1.3節中操作步驟，引物更換為HSP70-tPCR-F和HSP70-tPCR-R，獲得原核表達的DNA模板，隨后將其與線性化的pET-28a載體通過ClonExpress II一步克隆試劑盒(Vazyme, 南京)同源連接，并轉入到大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含有卡那霉素的LB瓊脂板上過夜培養，挑取陽性克隆進行菌液PCR，送至杰李(上海)生物技術公司測序。

表1 本研究所用引物

測序正確的質粒轉入到大腸桿菌BL21(Vazyme, 南京)感受態細胞中進行蛋白表達。次日挑選單克隆將其轉移至含卡那霉素(30 μg/mL)的100 mL新鮮LB液體培養基中，然后孵育至OD600=0.5，將異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Sango, 上海)添加至最終濃度為1 mmol/L，并在30℃ 200 r/min條件下過夜孵育12 h。在4℃ 11 000 r/min離心15 min得到菌液沉淀，并加入平衡緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4和Na2HPO4, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑, pH 7.9)，攪拌并通過在冰水中超聲處理破壞混合物。在4℃ 12 000 r/min離心20 min后，獲得上清。重組蛋白通過His60 Ni Superflow樹脂和重力柱(TaKaRa, 北京)純化，純化的重組蛋白用7.5% SDS-PAGE凝膠分析。

1.7 免疫印跡分析

以1.6節純化的HcHSP70蛋白作為抗原，取20 μL蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至0.45 μm的PVDF膜。用5%脫脂奶粉溶液封閉，將膜置于含His-tag抗體(Beyotime, 上海)的一抗孵育液中4℃孵育過夜，用TBST緩沖液洗膜，然后將膜轉入含有辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔IgG的二抗孵育液(Beyotime, 上海)中，室溫輕搖孵育1～2 h，洗膜后將膜置于West Pico ECL(Biosharp, 武漢)顯色拍照。

1.8 美國白蛾熱激蛋白70的酶活性測定

采用Zhang等(2018)的方法測定熱激蛋白70的酶活性。配制100 μL反應體系，包含2.0 μg HcHSP70/BSA/ddH2O, 1.0 mmol/L Bistris, 1.0 mmol/L KCl, 0.1 mmol/L MgCl2和0.01 mmol/L ATP，其中添加BSA/ddH2O為對照。將反應混合物在25, 30, 35和40℃下孵育10 min后，加入10 μL 55% HClO4終止反應。將混合物放置冰上10 min，然后以12 000 r/min 離心3 min。最后，用微量組織無機磷含量測定試劑盒(Solarbio, 北京)確定無機磷的濃度。熱激蛋白70的酶活性定義為1 min內1 mg HcHSP70催化的無機磷的產生量(μmol/min·mg)。

1.9 數據分析

利用IBM SPSS Statistics 20軟件進行數據處理，采用單因素分析法中的Duncan氏多重檢驗法對高溫處理下美國白蛾熱激蛋白70基因相對表達量及不同溫度下HcHSP70重組蛋白的ATP酶活性進行差異顯著性分析，差異顯著水平為P<0.05。

2 結果

2.1 美國白蛾HSP70基因的克隆以及序列

克隆獲得美國白蛾2條HSP70基因HcHSP70(GenBank登錄號: MT995848)和HcHSC70(GenBank登錄號: MT261583)，其ORF長度分別為1 917和2 061 bp，分別編碼637和687個氨基酸，分子質量分別約為69.66和74.96 kD，等電點分別為5.90和5.96。HcHSP70與HcHSC70氨基酸序列中存在HSP70家族中3個高度保守的區域GIDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和VGGSTRIPKVQ。并具有由AEAYLGKS組成的ATP-GTP結合位點及由PRALRRLRTAAERAKRTL組成的核定位信號標簽和非細胞器基序RARFEEL的3個典型特征也高度保守(圖1)。亞細胞定位預測HcHSP70位于細胞質中，HcHSC70位于線粒體中。

圖1 美國白蛾HcHSP70和HcHSC70與其他鱗翅目昆蟲HSP70氨基酸序列對比

利用SWISS-MODEL工具建模，HcHSP70與模板的一致性為53.86%，HcHSC70與模板的一致性為62.27%。預測的美國白蛾HcHSP70和HcHSC70蛋白的三維結構與其他物種熱激蛋白70的三維結構高度相似。如圖2所示，HcHSP70和HcHSC70的三維結構均是由N端ATPase功能域和C端底物結合功能域所組成。

圖2 美國白蛾HcHSC70(A)和HcHSP70(B)的SWISS-MODEL三維結構預測模型

如圖3系統進化樹所示：HcHSP70和HcHSC70分別屬于兩個分支，HcHSP70與鱗翅目HSP70家族的其他成員聚為一支，HcHSC70與鱗翅目HSC70家族的其他成員聚為另一支。此外，鞘翅目、半翅目、膜翅目及雙翅目各目的熱激蛋白70序列同樣分為HSP70及HSC70兩個分支。

圖3 鄰接法構建的基于氨基酸序列的美國白蛾和其他昆蟲HSP70系統進化樹(1 000次重復)

2.2 高溫脅迫下美國白蛾熱激蛋白70基因的相對表達量

從圖4(A)中可以看出，美國白蛾4齡幼蟲在30, 35和40℃下分別處理1, 2和3 h,HcHSP70的表達量與對照(25℃)相比顯著上調：在1 h時，隨著溫度的升高，HcHSP70基因的相對表達量持續上升；在35℃ 2 h時，相對表達量達到峰值，約為對照組的183.70倍；但在35和40℃處理3 h時，相對表達量與對照相比則無顯著性差異(P>0.05)。

由圖4(B)可知，與對照組(25℃)相比，HcHSC70在每個溫度梯度、不同時間的相對表達量與對照相比無顯著性差異，如在40℃下3 h時相對表達量最高，為對照組的4.76倍，但與對照相比無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 高溫處理不同時間后美國白蛾4齡第2天幼蟲中HcHSP70(A)和HcHSC70(B)的相對表達量

2.3 美國白蛾熱激蛋白70的重組表達與純化

HcHSP70重組質粒轉入BL21表達感受態細胞中的表達產物通過SDS-PAGE分析表明，在69.66 kD處檢測到一條明顯的誘導表達蛋白條帶，而pET-28a空載體則無相應的條帶，這與預測的分子量大小一致(圖5)。使用Ni2+-His柱進一步純化可溶性重組蛋白，并且純化的HcHSP70的濃度為1.7 mg/mL。通過重組蛋白HcHSP70與His-tag抗體發生特異性反應，表明HcHSP70基因已經在大腸桿菌表達系統中正確表達。

圖5 重組蛋白HcHSP70的SDS-PAGE分析

2.4 高溫下HcHSP70蛋白的ATPase活性

在25, 30, 35和40℃的溫度下測定純化的HcHSP70的ATPase活性分別為27.3039, 25.5823, 23.8551和26.2028 μmol/min·mg pro，高于BSA/ddH2O對照組的活性(圖6)。而且，隨著溫度的升高，HcHSP70蛋白的ATPase活性在不同溫度處理之間無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

本研究利用PCR技術首次在美國白蛾中克隆出2條熱激蛋白70家族基因的cDNA序列，分別命名為HcHSP70和HcHSC70。氨基酸序列分析表明，這2條基因具備HSP70家族保守的結構特點，并具有3個HSP70蛋白家族的簽名序列(Gupta, 1995)和3個真核細胞特征基序(圖1)。亞細胞定位的預測結果顯示HcHSP70定位于細胞質中，HcHSC70定位于線粒體中。線粒體作為真核細胞的重要“能量工廠”，是細胞進行呼吸等細胞代謝的主要場所(孫飛等, 2008)，所以推測HcHSC70可能參與了高溫下細胞的代謝過程。

熱激蛋白70家族分為誘導型HSP70和組成型HSC70兩種類型(Zhangetal., 2011)，前者在正常生理狀態下表達量極低，脅迫后大量上調；后者正常條件下含量較高，受到脅迫后僅微量上調或不上調。系統發育樹顯示，不同鱗翅目昆蟲的誘導型HSP70之間同源性高于同屬于美國白蛾的HcHSP70和HcHSC70之間的同源性，不同鱗翅目昆蟲的組成型HSC70之間的同源性同樣高于同屬于美國白蛾的HcHSP70和HcHSC70之間的同源性(圖3)。這表明雖然誘導型HSP70和組成型HSC70的序列結構特征十分相似，但熱激蛋白70基因在昆蟲進化的早期已經出現兩支，使得HSP70和HSC70各自在不同物種間的同源性更高(Delelis-Fanienetal., 1997)。

熱激蛋白70基因在轉錄水平參與美國白蛾幼蟲的熱脅迫響應。美國白蛾4齡幼蟲在熱激處理1 h后，HcHSP70的表達量上調，并且與溫度梯度呈正相關，在35℃處理2 h時表達量達到峰值(圖4: A)；而HcHSP70在熱激條件下僅微量上調或不上調(圖4: B)，暗示了HcHSP70在美國白蛾抵御熱脅迫時發揮重要作用。但HSP70的上調表達存在極限，如在40℃下2和3 h時HcHSP70表達量并沒有上調。這種現象與其他昆蟲熱激蛋白的轉錄響應特性一致，如松墨天牛Monochamusalternatus的MaltHSP21.20在45℃時表達量最高，而在50℃處理組中相對表達量呈現下降趨勢(李慧等, 2018)；煙粉虱Bemisiatabaci在41℃時HSP70基因表達量最高，在43和45℃時表達水平迅速降低(崔旭紅等, 2007)。這些結果表明，昆蟲熱激蛋白70對轉錄響應存在極限，一方面原因是當外界環境溫度過高時，會破壞昆蟲體內的正常生理狀況；另一方面熱激蛋白70過量的表達可能會影響昆蟲正常的生長發育，從而對許多生理過程如生殖等帶來負面影響(Krebs and Feder, 1997)。

本研究在對HcHSP70重組表達與純化的基礎上進行分子伴侶功能分析，發現HcHSP70在25, 30, 35和40℃下具有高且穩定的ATPase活性(圖6)。對松墨天牛的MaltHSP70-2研究中也得到相似結果(Lietal., 2020)。高溫脅迫下穩定的結構和構象是HSP70發揮分子伴侶功能的基礎，推測HcHSP70蛋白在美國白蛾應對熱脅迫中發揮著重要作用(趙超越, 2016)。但是本研究僅限于體外表達重組蛋白來驗證HcHSP70具有穩定的ATPase活性，還需要通過RNA干擾或者基因編輯技術進一步探究HcHSP70蛋白在美國白蛾抵御高溫脅迫中的作用。

本研究克隆獲得2條美國白蛾HSP70基因HcHSP70和HcHSC70，序列分析表明2條基因的編碼蛋白均符合熱激蛋白70家族的結構特征，并且亞細胞定位預測位于不同的細胞結構中；檢測了其在高溫處理下mRNA的相對表達量，表明HcHSP70和HcHSC70參與了美國白蛾抵御高溫脅迫的過程。此外，通過原核表達及純化獲得美國白蛾HSP70蛋白，并通過體外實驗證明重組蛋白HcHSP70在高溫處理下具有穩定的ATPase活性，進一步暗示HcHSP70是影響美國白蛾耐熱性的重要基因，可以為揭示美國白蛾的擴散機制以及預測潛在分布區提供參考。