外源施硒對小白菜硒富集與土壤生物活性的影響

唐俊杰，肖孔操，段鵬鵬，李德軍，劉永賢

（1. 中國科學院亞熱帶農業生態研究所亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南 長沙 410125；2. 中國科學院環江喀斯特生態系統觀測研究站，廣西 環江 547100；3. 中國科學院大學，北京 100049；4. 廣西壯族自治區農業科學院農業資源與環境研究所，廣西 南寧 530007）

硒是人和動物必需的微量營養元素，其在提高機體免疫力、延緩細胞老化及防癌抗癌等方面都具有非常重要的作用[1]。人體對硒的攝取主要來自于日常飲食，因而提高食物中的硒含量對于改善人體硒營養狀況具有重要意義。植物從土壤中吸收硒是硒進入食物鏈的第一步。鑒于全球大部分地區土壤含硒量低或生物有效性低，導致進入食物鏈中的硒水平整體較低，國際上普遍通過外源施硒等措施來提高作物硒含量，即生物強化（biofortification）[2-5]。 近年來，國內外學者從不同化學價態（如硒酸鹽SeO42-和亞硒酸鹽SeO32-）[6-8]、不同添加濃度[9-11]及不同施用方式（如葉施和土施）[12-13]等方面就外源施硒對作物生長、產量與品質、硒吸收與轉運的影響開展了大量的研究。另一方面，硒具有生物毒性，過量攝取會導致硒中毒，不同價態和形態硒的毒性也存在明顯差異。迄今為止，外源施硒是否以及如何影響土壤生物活性這方面的關注嚴重不足。以往在農業生產上常用的硒肥多為無機形態硒，包括亞硒酸鈉和硒酸鈉，但存在毒性強、肥料利用率低等問題。近年來，有機態硒肥憑借其低毒、環保等方面的優勢在生產應用中逐漸受到重視[14-16]。不同形態的硒肥施用對土壤生物活性的影響是否存在差異目前尚不明確。

外源施硒會對土壤生物活性（如微生物生物量、群落結構、代謝等）產生何種影響，目前相關認識十分缺乏。土壤微生物是土壤的重要組成部分，其在有機質分解、養分轉化與循環等方面起著關鍵性的作用，也是表征土壤肥力水平與生態環境質量的主要指標之一[17-18]。樊俊等[19]發現亞硒酸鈉和硒酸鈉在施用水平為5～10 mg/kg時可促進植煙土壤微生物數量增加，而施用水平達到30 mg/kg時，可導致土壤細菌和真菌數量下降。戴志華與涂書新[20]指出，外源硒高量施用時（20 mg/kg）可抑制水稻土微生物多樣性和豐度。程勤等[21]采用高通量測序技術研究發現，施用亞硒酸鈉顯著影響油菜根際土壤細菌群落結構，但對真菌群落結構影響不明顯。由此可見，低量的外源硒施用對土壤微生物生長有一定的促進作用，而高量外源硒施用則可能會抑制土壤微生物。然而，以往研究均采用無機硒，而有機態硒對土壤微生物的影響尚未見公開報道，有機態硒施用與傳統的無機硒施用效果是否存在差異尚未可知。

為此，本研究選擇兩種硒肥類型（亞硒酸鈉和氨基酸螯合態硒），并設置兩種不同濃度水平（土壤硒含量3 mg/kg和6 mg/kg），以常見蔬菜小白菜作為栽培作物，在研究不同形態與水平硒肥施用對小白菜硒富集影響的同時，探討了土壤生物活性的響應特征，以期為富硒蔬菜生產實踐與科學施硒提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小白菜（Brassica chinensisL.）選擇當地主栽品種“早熟5號”。供試土壤為石灰土，采自廣西環江縣中國科學院環江喀斯特農業生態試驗站試驗田。采用多點取樣法采集表層0～20 cm土壤，自然風干后研磨過2 mm篩。土壤pH值7.63，有機碳含量34.15 g/kg，全氮含量3.23 g/kg，有效磷含量15.2 mg/kg，粘粒19.7%，粉粒72.7%，沙粒7.6%，全硒含量0.89 mg/kg。亞硒酸鈉（Na2SeO3）（分析純，純度＞98%），購自于Sigma-Aldrich公司。氨基酸螯合態硒（以下簡稱“螯合硒”）由廣西壯族自治區農業科學院農業資源與環境研究所提供，是將亞硒酸鈉與氨基酸溶液經一定配比和工序螯合而成，硒含量為2 088.1 mg/L，有機硒含量占94.8%[22]。

1.2 試驗設計

本研究采用盆栽試驗，在廣西河池市環江縣中國科學院環江喀斯特農業生態試驗站進行。實驗共設置5個硒添加處理，包括加清水（對照）、亞硒酸鈉L1（土壤硒含量3 mg/kg）、螯合硒L1（土壤硒含量3 mg/kg）、亞硒酸鈉L2（土壤硒含量6 mg/kg）、 螯合硒L2（土壤硒含量6 mg/kg），以上硒添加水平均指純硒濃度，每個處理設置5個重復。本試驗中硒肥施用量參考杜振宇等[23]研究以及當地富硒蔬菜生產中的實際用量確定。具體試驗方法為：選擇直徑22 cm、深度為25 cm的塑料盆，每盆裝土5.7 kg，施入底肥（10 g復合肥+ 500 g腐熟牛糞）混勻。將亞硒酸鈉用去離子水配成溶液，氨基酸螯合態硒則按相應比例稀釋以后加入土壤中拌勻。土壤裝盆平衡72 h后，將提前育苗的5株小白菜幼苗移栽至花盆中。待幼苗長出第三片葉后，再間苗至每盆1株。整個試驗期間植株均在自然光照條件下生長，其他管理措施按當地習慣進行。間苗40 d后，將小白菜按地上和根系分別收獲，用去離子水洗凈表面附著泥土后，烘干稱重，記錄干物質量，然后用球磨儀粉碎過0.15 mm篩，分析其中的硒含量。將各處理盆栽土壤過2 mm篩，剔除細根與石子后混勻，經冷凍干燥的8 g土壤用于測定土壤微生物群落結構（PLFA法），其余鮮土于4 ℃冰箱中保存，用于測定土壤酶活性。

1.3 測定方法

土壤pH采用pH計測定（土水比1∶2.5）；有機碳（SOC）含量用重鉻酸鉀容量法；全氮采用凱氏定氮法；土壤顆粒組成用激光粒度儀測定；植物硒用氫化物發生-原子熒光光譜法（北京吉天HGAFS830原子熒光分光光度計）測定；土壤PLFA測定方法如下：用經冷凍干燥的8 g土壤，進行樣品的浸提、分離、酯化、萃取，再用N2吹干，最后用加內標的正已烷溶解。以19∶0甲酯作為內標物，在氣相色譜儀上采用MIDI軟件識別各種PLFA組分，并測定含量[24]。最后將各類PLFA劃分為細菌、真菌、放線菌、原生動物與綠藻。土壤β-乙酰葡糖胺糖苷酶（NAG）與堿性磷酸酶（ALP）活性使用酶標儀測定，測定方法參考文獻[25]。

1.4 數據分析

用Excel 2019軟件整理數據并進行作圖；用SPSS 16.0軟件（SPSS Inc.， Chicago，IL，USA）進行統計分析，在統計分析前檢驗所有數據的正態性與同質性。采用方差分析（ANOVA）確定不同硒添加處理間小白菜生物量、硒濃度、富集轉運系數、土壤微生物量、群落結構和土壤酶活性的差異是否顯著，并在P＜ 0.05水平下檢驗差異顯著性。采用皮爾森相關性分析確定土壤微生物群落PLFA含量、土壤酶活性與小白菜硒濃度之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 小白菜生物量

如圖1所示，不同形態與水平硒添加對小白菜地上和根系生物量的影響不一。與對照相比，3 mg/kg 亞硒酸鈉處理對小白菜地上生物量沒有顯著影響，而6 mg/kg亞硒酸鈉處理小白菜地上部分生物量顯著降低，降幅達30%（圖1A）。兩個水平的螯合硒添加均未對小白菜地上部分生物量產生顯著影響（圖1A）。另一方面，兩個水平亞硒酸鈉添加對小白菜根系生物量均沒有顯著影響，而3 mg/kg螯合硒處理小白菜根系生物量顯著高于對照（圖1B）。這與吳雄平等[26]的研究結果有所不同，其用西北紅油土（pH=7.75）進行盆栽試驗發現，亞硒酸鈉添加量在＜10 mg/kg時，其對小白菜生長均表現出促進效果；當亞硒酸鈉添加量達到60 mg/kg時，對小白菜根系生長才有明顯抑制。可見小白菜在西北紅油土中生長時對亞硒酸鈉毒性的耐受能力要遠高于在西南石灰土中。此外，Cartes等[27]用火山灰土（pH=5.75）進行盆栽試驗發現，亞硒酸鈉添加量在10 mg/kg以內，其對黑麥草生長沒有顯著影響。以上表明，不同的植物種類以及外界環境（如土壤性質）可對外源施硒效應造成極大的影響。

2.2 小白菜硒富集與轉運

不同形態與水平外源施硒對小白菜硒富集的影響也有所差異（圖2）。與對照相比，亞硒酸鈉處理小白菜地上硒濃度有顯著提升，而螯合硒處理地上部分硒濃度雖然也有一定程度的增加，但并未達到統計差異顯著水平（P＞ 0.05，圖2A）。相同施用水平條件下，亞硒酸鈉處理小白菜地上硒濃度顯著高于螯合硒處理（圖2A），表明亞硒酸鈉施用后對小白菜的生物可利用性更高。此外，外源施硒處理下小白菜根系硒濃度均顯著高于對照（圖2B）。相同施用水平條件下，亞硒酸鈉和螯合硒處理小白菜根系硒濃度無顯著差異（圖2B）。從整株角度來看，兩個水平亞硒酸鈉處理均顯著提升小白菜硒濃度，螯合硒處理則僅在施用水平達到6 mg/kg時才可顯著促進小白菜硒富集（P＜ 0.05，圖2C）。杜振宇等[23]利用棕壤進行的一項盆栽研究結果表明，當亞硒酸鈉施用量為3 mg/kg和6 mg/kg時，整株小白菜硒平均濃度可分別達到4.34 mg/kg和8.02 mg/kg。而本試驗中，3 mg/kg與6 mg/kg亞硒酸鈉施用處理整株小白菜平均硒濃度分別僅為0.40 ± 0.05 mg/kg與0.67 ± 0.15 mg/kg（圖2C）。造成如此差異的原因一方面可能與所采用土壤的理化性質有關。如本研究所采用的石灰土有機碳含量（34.15 g/kg）遠高于杜振宇等[23]所采用的棕壤（5.28 g/kg）。以往研究證實，土壤有機碳對硒具有較強的固定作用[28]，因而高量的土壤有機碳可導致硒的植物可利用性大幅降低。另一方面可能與不同小白菜品種之間本身對硒的富集能力存在巨大差異有關。如有前人研究發現，不同品種大豆之間的硒累積能力可相差達數十倍[29]。

本研究進一步計算了生物富集系數（BCF，小白菜硒濃度與土壤硒濃度的比值）與轉運系數（TF，小白菜地上部分硒濃度與根系硒濃度的比值）。BCF和TF可分別用來表征小白菜從土壤中吸收富集硒能力的強弱和硒從根系向地上部分遷移的能力[30-31]。如表1所示，亞硒酸鈉處理BCF地上部/土壤值要顯著高于螯合硒和對照處理。不同水平亞硒酸鈉處理之間BCF地上部/土壤值無顯著差異，這與Li等[31]的研究發現一致。本研究中小白菜硒轉運系數（TF）值平均在0.08～0.20之間，處于較低水平[30]，這表明亞硒酸鹽和螯合態硒被小白菜根系吸收后極易在根部固定以致向地上部分轉運不足[32]。

表1 不同形態與水平硒添加處理的小白菜生物富集系數（BCF）與轉移系數（TF）Table1 The bioconcentration factors and translocation factors of pakchoi as affected by applying exogenous Se fertilizers with different forms and levels

2.3 土壤微生物生物量與群落結構

如圖3所示，與對照相比，3 mg/kg亞硒酸鈉與3 mg/kg螯合硒兩個處理土壤總PLFA含量沒有顯著變化，而6 mg/kg亞硒酸鈉和6 mg/kg螯合硒兩個處理土壤總PLFA含量均顯著降低，降幅分別達到22%和16%（圖3A）。土壤細菌PLFA含量變化趨勢與總PLFA含量類似，6 mg/kg亞硒酸鈉和6 mg/kg螯合硒兩個處理相比對照細菌PLFA含量降幅分別達到22%和17%（圖3B）。土壤真菌PLFA含量僅在6 mg/kg亞硒酸鈉處理下有顯著下降，降幅達30%，而其余三個硒添加處理與對照相比無顯著差異（圖3C），這表明高濃度亞硒酸鈉可對真菌產生較強的抑制作用。土壤放線菌PLFA含量在兩個水平亞硒酸鈉處理下均顯著低于對照，降幅分別為11%和19%，而螯合硒僅在6 mg/kg添加條件下顯著降低放線菌PLFA含量，降幅15%（圖3D）。土壤原生動物PLFA含量僅在6 mg/kg亞硒酸鈉處理下顯著低于對照，降幅高達36%，其余三個施硒處理與對照相比無顯著差異（圖3E）。當兩種形態硒施用量為3 mg/kg時，土壤綠藻PLFA含量與對照相比無顯著差異，但在施用水平達到6 mg/kg時，土壤綠藻PLFA含量均顯著低于對照（圖3F）。

不同形態與水平外源硒施用下，土壤微生物群落結構組成也發生一定變化（表2）。與對照相比，6 mg/kg螯合硒處理顯著降低細菌在微生物群落中的占比，而6 mg/kg亞硒酸鈉處理顯著降低綠藻在微生物群落中的占比。相比3 mg/kg亞硒酸鈉處理，6 mg/kg亞硒酸鈉處理顯著降低土壤真菌占比而提高放線菌占比。兩個不同水平的螯合硒添加處理之間土壤微生物群落組成則未見明顯差異。原生動物在微生物群落中的占比在不同硒處理之間未發現明顯變化。

表2 不同形態與水平硒添加處理下土壤微生物各類群占比（%）Table 2 The effects of applying exogenous Se fertilizers with different forms and levels on the proportion of soil microbial groups

2.4 土壤酶活性

NAG酶和ALP酶是參與土壤關鍵養分氮和磷轉化的主要酶類[33-34]。如圖4所示，與對照相比，兩個水平亞硒酸鈉施用對土壤NAG與ALP酶活性均未產生顯著影響。這與Nowak等[35]的結果相符合，其發現外源硒施用水平在3.95～39.5 mg/kg時，對土壤磷酸酶活性都沒有顯著影響。此外，吳雄平等[36]的盆栽實驗結果也證實，0～20 mg/kg亞硒酸鈉與硒酸鈉對小白菜土壤磷酸酶活性無顯著影響。另一方面，3 mg/kg螯合硒處理對土壤NAG、ALP酶活性也沒有顯著影響，而6 mg/kg螯合硒處理土壤NAG、ALP酶活性均有顯著增加（圖4），可見無機態硒和螯合態硒對土壤酶活性存在不同影響。與本研究結果類似，史雅靜等[37]通過室內培養實驗研究發現，亞硒酸鈉添加量＜ 30 mg/kg時，土壤磷酸酶活性與對照相比沒有顯著變化；而施用有機態硒（硒代蛋氨酸）＜ 30 mg/kg時，對土壤磷酸酶有不同程度的激活作用。高量的螯合硒處理之所以顯著增加土壤NAG酶和ALP酶活性，可能是因為螯合硒溶液含有較高濃度的游離氨基酸，在高量添加的情況下刺激土壤微生物分泌大量分解氨基酸的酶（即NAG酶）。微生物在氮供應充足的情況下，對磷的需求也隨之增加，進而大量分泌磷酸酶以便從土壤中獲取磷。

2.5 土壤生物活性與小白菜硒吸收的相互關系

如表3所示，小白菜根系硒濃度與土壤微生物群落總PLFA含量呈顯著負相關（P＜ 0.05），具體到各土壤微生物群落，小白菜根系硒濃度與土壤細菌、放線菌、綠藻PLFA含量呈顯著負相關關系（P＜ 0.05）。小白菜地上硒濃度與土壤微生物各群落PLFA含量均無顯著相關性。這一方面可能與微生物與小白菜在硒吸收上形成直接競爭有關[38]。另一方面則可能是因為微生物活動一定程度上促進了硒揮發損失[39]，使得土壤中硒的有效性降低，進而引起植物吸收減少。土壤NAG與ALP酶活性與小白菜硒濃度之間未發現顯著相關性。

表3 土壤生物活性與小白菜硒濃度間的相關性Table 3 Correlationships between soil biological activities and selenium concentration in pakchoi.

3 討論

3.1 外源硒添加對小白菜硒富集的影響

植物對硒的吸收、運移與代謝機制等方面的認識迄今尚不完全明晰[32,40-42]。一般認為，植物根系可以吸收利用的硒形態主要有硒酸鹽、亞硒酸鹽以及部分有機硒復合物，如硒代蛋氨酸（SeMet）等[30]。硒酸鹽主要是通過根系細胞膜中的硫轉運蛋白與轉運通道[43-44]，而亞硒酸鹽則更有可能是通過磷轉運通道進入到植物體內[43]。亞硒酸鹽進入根系細胞后，能夠迅速轉化成有機硒并在根部累積；而硒酸鹽進入根系細胞后，很少會被轉化成有機硒而大多轉移到植物地上部分[27,45-46]。本試驗結果表明，外源施硒不同程度提高了小白菜植株硒濃度（圖2），這與以往的研究發現一致[6,47-48]。小白菜根系硒濃度總體上要高出其地上部分硒濃度一個數量級以上，說明小白菜從土壤中吸收的硒絕大部分被固定在根系而不是向地上部分轉運。根據《GH/T 1135-2017富硒農產品行業標準》：蔬菜類富硒食品的總硒含量應在0.10～1.00 mg/kg之間，本研究4個外源硒添加處理下小白菜地上部分硒濃度在0.15～0.53 mg/kg范圍內，達到富硒蔬菜標準。按照中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會疾控局在《中國居民膳食指南（2016）》中建議每天蔬菜食用不超過500 g，本研究中小白菜地上部分濃度最高0.53 mg/kg，折算日均硒攝入量為265 μg，處于我國衛生和計劃生育委員會在《WST578.3-2017中國居民膳食營養素參考攝入量》中規定的40～400 μg/d安全閾值范圍內，表明本研究所涉處理下生產的富硒小白菜不會造成硒攝入過量中毒風險。

本研究結果表明，亞硒酸鈉處理下小白菜硒富集效果要顯著優于螯合硒處理（圖2），這可能是因為螯合硒是由硒素與氨基酸螯合而成一種大分子物質，其施入土壤后有效性不如亞硒酸鈉所致。通過對兩種不同形態硒肥處理土壤中可提取態有效硒含量進行分析，我們發現3 mg/kg與6 mg/kg螯合硒處理土壤中可提取態有效硒平均含量分別為0.16 mg/kg和0.49 mg/kg，而相應亞硒酸鈉處理則分別達到0.68 mg/kg和0.82 mg/kg。可見，亞硒酸鈉處理土壤中硒的生物有效性遠大于螯合硒處理。此外，我們還發現，不同形態的硒肥其施用量增加后對小白菜地上部分與根系硒富集的影響不一（圖2）。例如，高量亞硒酸鈉處理相比其低量處理明顯促進地上部分硒累積，而對根部硒累積無顯著影響；高量螯合硒處理相比其低量處理則顯著促進小白菜根部硒累積，而對地上部分硒累積無明顯影響。可見，僅從提高小白菜可食部分硒濃度的角度來看，施用亞硒酸鈉效果要明顯優于施用螯合硒。

3.2 外源硒添加對土壤微生物的影響

目前關于外源施硒對土壤微生物群落影響的認識十分不足。本研究發現，相比對照，添加3 mg/kg 的亞硒酸鈉或螯合硒均未對土壤總PLFA含量造成顯著影響，而添加6 mg/kg亞硒酸鈉或螯合硒則都導致土壤總PLFA含量顯著降低（圖3A），說明硒施用水平達到6 mg/kg時可對土壤微生物群落生長造成顯著抑制作用，這與前人的研究認識具有一致性[19-20]。此外，不同微生物類群對外源硒的敏感性也存在差異。本研究中，土壤細菌PLFA含量在3 mg/kg硒施用水平時響應不明顯，而在6 mg/kg硒施用水平時則顯著降低（圖3B），說明外源硒對細菌的影響更取決于用量水平，而非形態；土壤真菌PLFA含量在6 mg/kg螯合硒處理下與對照差異不明顯，而在6 mg/kg亞硒酸鈉處理下則顯著下降（圖3C），說明真菌對高濃度螯合硒的耐受能力要強于其對高濃度亞硒酸鈉的耐受能力；此外，土壤放線菌PLFA含量在亞硒酸鈉3 mg/kg水平施用時即顯著降低，而螯合硒處理僅在施用水平達到6 mg/kg時才有明顯減少（圖3D），說明土壤放線菌群落對亞硒酸鈉比螯合態硒敏感性高。然而，雖然本研究發現土壤微生物群落對不同形態與水平外源硒施用存在差異化響應，但對這種差異形成的機制尚不明確，有待進一步的探討。

4 結論

本研究結果表明，外源施硒對小白菜生物量、硒富集以及土壤微生物群落和酶活性的影響與硒形態和用量密切相關。

1）與不施硒相比，施硒處理均顯著促進小白菜植株硒富集。其中，施用亞硒酸鈉對小白菜可食用部分硒富集的促進效果優于施用螯合硒。

2）土壤微生物群落對外源施硒的響應主要由施用水平決定，而不是形態。高量的外源硒肥施用通常會對土壤微生物產生抑制作用。未來可進一步研究以明確土壤微生物對不同形態硒的響應閾值。

3）亞硒酸鈉施用，無論是3 mg/kg還是6 mg/kg 水平，對土壤NAG、ALP酶活性均未觀察到顯著影響。螯合硒在3 mg/kg水平施用時對土壤NAG、ALP酶活性無顯著影響，而在6 mg/kg水平施用時顯著刺激土壤NAG、ALP酶活性。可見，高水平的螯合硒施用會對土壤生物活性造成深刻影響，進而潛在影響其他養分元素如氮磷等的循環，應予以重視。