BSA-Gd2O3-HSP90靶向型納米探針標記口腔鱗癌細胞及瘤體磁共振成像處理

林李芃，閆翔宇，袁崢鼎，戴家杰，濮芷青，徐凱，王永?

（1.徐州醫科大學醫學影像學院，江蘇 徐州；2.徐州醫科大學口腔醫學院，江蘇 徐州；3.徐州醫科大學公共衛生學院，江蘇 徐州；4.徐州醫科大學附屬醫院 醫學影像科，江蘇 徐州）

0 引言

近年來，口腔鱗癌（Oral Squamous Cell Carcinomas,OSCC）的發病率不斷增加，因其易發生區域淋巴結轉移等疾患問題，預后相對較差。因此控制腫瘤細胞轉移路徑對該腫瘤的治療和預后都起著重要作用。隨著各類成像技術的發展，在衍生出的一系列非侵襲性檢測手段中，分子影像動態監測更有助于明確目標腫瘤的轉移路徑和部位，從而清晰掌握口腔鱗癌動態治療手段[1]。熱休克蛋白（Heat Shock Protein, HSP）是一種能在體內特異性高表達的蛋白，主要在細胞分化及基因轉錄等方面發揮主要作用，又名“伴侶蛋白”。而其中熱休克蛋白90（Heat Shock Protein 90,HSP90）又與腫瘤發展、轉移及預后最具相關性，HSP90能較松弛地結合在腫瘤細胞細胞膜表面，靶向性指引腫瘤細胞遷移軌跡[2-3]。而在口腔細胞中，HSP90與口腔鱗癌細胞的分化增殖相關，可在其中高度特異性表達。在前期研究中我們可以證明BSA-Gd2O3能夠作為可靠的磁共振成像（MRI）納米探針載體，基于BSA-Gd2O3能夠制備出可有效地標記腫瘤細胞的靶向型納米探針[4]。

本實驗在上述研究的基礎上，運用BSA-Gd2O3對比劑與鼠抗人HSP90結合形成的納米探針靶向示蹤體外口腔鱗癌細胞，根據原始圖像及Matlab7.0系統處理后圖像成像效果對其示蹤機制進行探討，為以動物模型為基礎的影像提取實驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器及設備

主要包括：B13-3型磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司），HERACELL 150i二氧化碳培養箱（上海寶賽生物科技有限公司），L400臺式低速自動平衡離心機（湘儀實驗室儀器開發有限公司），DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），電熱恒溫水溫箱（北京醫療設備廠），電子天平BSM120.4（上海市卓精電子科技有限公司），3.0T全身磁共振成像設備（GE Discovery 750w，美國GE公司）等。

1.1.2 試劑

主要包括：新生牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），六水硝酸釓（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），PBS緩沖液粉末pH7.3（北京中山金橋生物科技有限公司），口腔鱗癌Cal-27細胞（上海中喬新舟生物科技有限公司），MEM基礎培養基（上海中喬新舟生物科技有限公司），青霉素-鏈霉素溶液（上海碧云天生物技術有限公司），胰蛋白酶（上海碧云天生物技術有限公司），無血清凍存液（徐州微科曼得生物工程有限公司），HSP90抗體（鼠抗人熱休克蛋白90，北京義翹神州生物技術有限公司），磷酸二氫鈉（南京化學試劑有限公司）等。

1.1.3 耗材

主要包括：10 mL及50 mL離心管（美國Corning公司），3500Da透析袋美國SpectrumLabs公司，六孔培養板（美國Corning公司），巴氏管（美國Corning公司）培養瓶，EP管（美國AXYGEN公司），移液器槍頭（美國AXYGEN公司）等。

1.2 制備BSA-Gd2O3磁共振納米探針

按我們前期實驗的方法[5]，稱取BSA（牛血清蛋白）250 mg溶解于9 mL水中，緩慢加入1 mL 50 mol/L的六水硝酸釓后劇烈攪拌，5 min后加入1 mL 2 mol/L的氫氧化鈉后劇烈攪拌，混合后置于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴加熱，同時在底部加入直徑1 cm的磁珠后將其置于磁力攪拌器上以1200 r/min的速度劇烈攪拌12 h。充分反應后，將溶液倒入3500Da的透析袋中，將透析袋包被完整置于磁力攪拌器上以轉速500 r/min攪拌30 h，分別間隔3 h、5 h、16 h后換水。透析后溶液體積由10 mL稀釋為20 mL，從中取8 mL離心后取上清液分散于3.2 mL 20 mol/L的PBS（pH=7.4）緩沖液中，得到非均一的絮狀乳白色沉淀。制備及儲存過程中避光。將制備好的BSA-Gd2O3對比劑用3.0T磁共振掃描儀檢測信號正常后置于4 ℃冰箱中備用。

1.3 Cal-27口腔鱗癌貼壁細胞模型建立

將復蘇后的口腔鱗癌Cal-27細胞置于含10%胎牛血清的EME培養基中（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），在37 ℃、5% CO2、相對濕度95%的條件下培養1周。待細胞貼壁密度達到80%后用0.25%胰蛋白酶消化，每3天傳代1次，取對數生長期的細胞進行實驗操作。

1.4 Cal-27細胞的體外對比劑靶向結合

將1 mg EDC、鼠抗人HSP90抗體與300 μL PBS緩沖液混合，37 ℃水浴加熱15 min后加入1 mg NHS及500 μL傳代后的口腔鱗癌Cal-27細胞并混合均勻，37 ℃水浴2 h后接種到6孔接種板上，設置孔板階梯濃度分別為：0（空白對照組），10%，30%，50%，70%，100%，每孔加入 PBS緩沖溶液定容至500 μL，待充分混合1 h后用胰蛋白酶消化收集細胞，保存在濃度為35%的甲醛溶液中，檢測口腔鱗癌細胞與HSP90抗體結合情況。

1.5 Cal-27瘤體MR成像及圖像分析

將上述細胞懸液注入目標裸鼠體內后培養成瘤，置于3.0T全身磁共振成像設備下獲取瘤體原始圖像。應用Matlab7.0系統處理圖像：首先讀取原始MRI圖像，對圖像進行判斷：如果為三通道的RGB圖像，先進行圖像灰度化。接著進行灰度反轉、陰影濾波、平滑濾波、邊緣增強、輪廓濾波。最后生成植入Cal-27細胞后的裸鼠MRI的T1橫斷面圖像處理結果。

2 結果

2.1 圖像處理效果比較

見圖1、圖2。

圖1 未經處理的MRI T1橫斷面原始圖像

圖2 處理后的T1橫斷面（圖像從左至右從上至下依次是原圖像、灰度反轉、陰影濾過、平滑濾波、邊緣增強、輪廓濾波）

2.2 部分代碼及說明

% 中值濾波來做圖像平滑，濾波模板為3*3

I_medfilt = medfilt2(I_src,[3 3]);

subplot(2,3,4);

imshow(I_medfilt);

title('平滑濾波');

% canny邊緣檢測算子來進行邊緣檢測

I_canny=I_src;

BW1=edge(I_canny,'canny');

I_canny=double(I_canny);

g=[0-0.40;-17-1;0-0.40]/5;

m=filter2(g,I_canny);

k=0.9;

I_enhance = I_canny+k*m+double(BW1);

subplot(2,3,5);

imshow(uint8(I_enhance));

title('邊緣增強');

BW2=edge(I_canny,'sobel');

[I_x,I_y]=gradient(double(I_canny));

I_gradient =I_x.*I_x+I_y.*I_y;

I_gradient =I_gradient+I_canny;

subplot(2,3,6);

imshow(I_gradient,[]);

title('輪廓濾波');

2.3 口腔鱗癌細胞的靶向磁共振信號表征

分別配制成釓離子濃度為 0、0.05、0.1、0.3、0.7、1 mmol/L的溶液，用3.0T Discovery 750w MRI測量不同濃度的T1弛豫時間，計算T1弛豫率。

掃描參數為：① 冠狀位T1WI：TE=Out of phase，TR=16.0 ms，矩陣 =288×288，FOV=18 cm×18 cm，層厚 =1.0 mm。②軸位 T1WI：TE=Out of phase，TR=21.1 ms，矩陣=256×256，FOV=6 cm×6 cm，層厚=1.0 mm。

3 討論

大量的探索和研究已經為磁共振示蹤口腔鱗癌的臨床應用奠定了基礎，在臨床治療層面上，在體水平上圖像示蹤靶點的位置改變預示著臨床應用上口腔鱗癌的不同分期，術中組織學和圖像引導手術等發展目標是在手術過程中更準確地描繪腫瘤的邊界，使腫瘤切除更加準確[6]。磁共振（MRI）已經成為腫瘤早期篩查及實驗模型植入腫瘤示蹤的利器，利用Matlab7.0對圖像進行平滑濾波、邊緣增強、輪廓濾波等操作，為磁共振圖像提供更加直觀的方位閱覽。圖中對比結果顯示口腔鱗癌腫瘤的MRI處理圖像明顯好于原始圖像，處理界面清晰，且腫瘤信號在靶向對比劑的引導下表達更為強烈，為臨床診斷口腔鱗癌起到輔助作用。因此，如何更好地將納米探針對比劑運用于體外目標細胞培養以及使用輔助性圖像系統處理目標磁共振圖像都是日后口腔鱗癌分子影像技術靶向示蹤的重要研究方向。