腺病毒肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA的表達(dá)變化*

張倫敏，張 翔

(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/遵義市第一人民醫(yī)院兒科，貴州 遵義 563003)

腺病毒(adenovius)肺炎占兒童病毒肺炎的4%～10%，是嬰幼兒肺炎中最嚴(yán)重的類型之一。重癥腺病毒肺炎患者發(fā)熱時(shí)間長(zhǎng)、臨床表現(xiàn)重，易發(fā)生多系統(tǒng)并發(fā)癥，病死率較高，后遺癥較多[1]。自20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)并成功分離腺病毒以來，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了100余個(gè)血清型，其中人類腺病毒根據(jù)物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)分為A～G 7個(gè)亞群，52個(gè)血清型。3、7型腺病毒為腺病毒肺炎的主要病原，7型更易導(dǎo)致重癥肺炎[2-3]，也有55型可以引起兒童肺炎的文獻(xiàn)報(bào)道[4]。目前，腺病毒肺炎發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是近年來在人和鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的具有顯著免疫抑制作用的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，已有研究證明，Treg主要通過細(xì)胞與細(xì)胞接觸或通過分泌細(xì)胞因子在機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)中起著非常重要的作用[5-7]，F(xiàn)oxp3是CD4+CD25+Treg的特異性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)CD4+CD25+Treg的發(fā)育成熟和發(fā)揮免疫抑制功能具有重要作用，其水平的高低可以反映CD4+CD25+Treg功能狀態(tài)。本研究通過檢測(cè)腺病毒肺炎患兒外周血特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)水平，探討其在兒童腺病毒肺炎中的免疫致病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年12月本科收治的30例住院患兒作為病例組，其中男17例，女13例；年齡3個(gè)月至12歲，平均(5.2±2.0)歲。選取同期在本院健康體檢兒童30例作為對(duì)照組，其中男18例，女12例；年齡1～11歲，平均(6.2±3.1)歲。2組研究對(duì)象年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《兒童腺病毒肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》[8]；(2)病原學(xué)檢測(cè)為腺病毒；(3)治療前1個(gè)月未使用影響免疫系統(tǒng)功能類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有其他自身免疫系統(tǒng)疾病；(2)合并嚴(yán)重肝、心、腎疾病及惡性腫瘤疾病。

1.2試劑與儀器 Trizol試劑(Invitrogen公司)，人淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限公司)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(Eppendorf公司)，核酸蛋白微量分析儀(Thermo公司)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]，凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，β-actin、Foxp3引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

表1 檢測(cè)基因與對(duì)應(yīng)的引物序列

1.3方法 采集患兒及正常健康兒童空腹外周血3 mL，淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，采用Trizol一步法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，取總RNA樣品2 μL用核酸微量分析儀檢測(cè)其RNA的濃度及在260 nm和280 nm下的光密度比值(OD260/280值)進(jìn)行純度鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。 qRT-PCR反應(yīng)條件：變性(95 ℃，3 min)；退火(95 ℃，5 s)；延伸(60 ℃，30 s)；循環(huán)(40個(gè)周期)。各樣本相對(duì)表達(dá)量采用國(guó)際通用的相對(duì)定量法(2-ΔΔCT法)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以Ct值為統(tǒng)計(jì)參數(shù)依次計(jì)算下列數(shù)據(jù)：ΔΔCt=(Ct目的-Ct內(nèi)參)病例組-(Ct目的-Ct內(nèi)參)對(duì)照組，目的基因相對(duì)于某基因的表達(dá)量=2-ΔΔCT。

2 結(jié) 果

2.1部分標(biāo)本電泳圖、擴(kuò)增及熔解曲線 Foxp3 mRNA部分標(biāo)本qRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(圖1)。β-actin、Foxp3 mRNA基因的qRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物單一，熔解曲線未見雜峰，均為單一峰，擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，指數(shù)期明顯，排除了非特異性擴(kuò)增和引物二聚體，擴(kuò)增產(chǎn)物較好(圖2～5)。

1.marker；2、3.β-actin；4、5.Foxp3。

圖2 基因Foxp3擴(kuò)增曲線

圖3 基因Foxp3溶解曲線

圖4 基因 β-actin 擴(kuò)增曲線

圖5 基因β-actin溶解曲線

2.2Foxp3 mRNA的表達(dá)水平比較 病例組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)水平(1.12±0.56)明顯低于對(duì)照組(5.16±3.59)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.63，P<0.001)。

3 討 論

腺病毒是一群分布十分廣泛的DNA病毒，主要在細(xì)胞核內(nèi)繁殖，耐溫、耐酸、耐脂溶劑的能力較強(qiáng)，除咽、結(jié)合膜及淋巴組織外，還在腸道繁殖，具有高滴度、高免疫原性等特點(diǎn)，常在扁桃體等淋巴組織中潛伏。腺病毒肺炎的主要病理改變?yōu)榫衷钚曰蛉诤闲詨乃佬越?rùn)和(細(xì))支氣管炎，臨床上大約有近1/3 的腺病毒肺炎因各種原因轉(zhuǎn)變?yōu)橹匕Y腺病毒肺炎[9]，導(dǎo)致多器官功能衰竭。在一些病毒感染中，免疫失調(diào)對(duì)疾病進(jìn)展起著關(guān)鍵作用，局部過度的免疫反應(yīng)會(huì)引起組織損傷與器官衰竭，而不充分的免疫反應(yīng)則不利于病毒清除[10]。已有研究證實(shí)，CD4+T淋巴細(xì)胞能識(shí)別腺病毒衣殼蛋白[11]，具有免疫應(yīng)答正性調(diào)節(jié)功能，其中輔助性T淋巴細(xì)胞(Th1)主要分泌干擾素(IFN)-γ、IFN-α、白細(xì)胞介素(IL)-2等炎性細(xì)胞因子增強(qiáng)抗感染能力，Th2主要分泌IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子輔助B淋巴細(xì)胞活化參與機(jī)體體液免疫。兩者之間相互抑制增殖，由此說明Th1與Th2比例的失衡可能參與了病毒感染的發(fā)生[12]，隨著分子免疫學(xué)研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)Th1/Th2平衡失調(diào)并不能完全闡明腺病毒肺炎的發(fā)病機(jī)制。

CD4+CD25+Treg一類具有免疫抑制功能的細(xì)胞亞群，主要分泌IL-4、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等抑制自身炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子，防止引起組織破壞的病理性免疫應(yīng)答發(fā)生，同時(shí)也是病原體長(zhǎng)期存在難以清除的因素，延長(zhǎng)了慢性感染的病程。Foxp3是CD4+CD25+Treg發(fā)育及啟動(dòng)抑制功能的關(guān)鍵基因，調(diào)控著Treg在胸腺的發(fā)育、外周的表達(dá)及功能的維持，是CD4+CD25+Treg特征性標(biāo)記，其表達(dá)水平的高低能反映CD4+CD25+Treg的活性。有研究證實(shí)，成熟小鼠或人類缺失Foxp3、CD4+CD25+Treg將失去其抑制能力，同時(shí)增強(qiáng)組織炎性反應(yīng)，從而提示Foxp3持續(xù)表達(dá)對(duì)CD4+CD25+Treg的穩(wěn)定起著重要作用[13]。目前，關(guān)于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Foxp3與兒童腺病毒肺炎發(fā)病關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道較少，本研究通過檢查腺病毒肺炎患兒外周血中CD4+CD25+Treg的Foxp3表達(dá)水平，探討了Foxp3在兒童腺病毒肺炎發(fā)病機(jī)制中的作用，結(jié)果顯示，病例組患兒外周血中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示兒童腺病毒肺炎CD4+CD25+Treg水平降低和活性減弱，對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)喪失負(fù)性調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致腺病毒肺炎的發(fā)生、發(fā)展，但Foxp3在兒童腺病毒肺炎發(fā)病過程中更深層的作用及影響其轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的因素尚有待于進(jìn)一步研究。