血清25-羥維生素D、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值與乙肝肝硬化的相關(guān)性分析

馬珺珂，任慧，邢曙光，孫軍

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧 錦州 121000；2.錦州市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 錦州 121000）

在我國(guó)，由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染引起肝硬化的比例為60%［1］。慢性乙型肝炎在導(dǎo)致肝損傷之后，引發(fā)肝臟慢性炎癥，激發(fā)肝星狀細(xì)胞，產(chǎn)生膠原纖維，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，引起肝臟纖維化，而肝纖維是一切慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。維生素D 屬于類固醇衍生物，是人體必需的脂溶性維生素，它的重要作用表現(xiàn)在血鈣、磷代謝，此外維生素D 還有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化、抗纖維化等多種生物學(xué)功能［2］。維生素D 在肝內(nèi)活化為25-羥維生素D，被認(rèn)定是測(cè)定維生素D 最可靠的指標(biāo)。近年研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝肝病患者中普遍存在維生素D 缺乏現(xiàn)象，維生素D 減少會(huì)加速肝臟疾病劑進(jìn)展、增加炎癥反應(yīng)和感染風(fēng)險(xiǎn)，與晚期預(yù)后不良有關(guān)［3］。中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（neutrophil-lymphocyte ratio,NLR）是血象中新型炎癥指標(biāo)，既往研究顯示NLR 與心血管疾病、自身免疫疾病、腫瘤等密切相關(guān)［4-5］。近年來(lái)研究顯示［6］，NLR 與慢性HBV 感染的慢加急性肝衰竭（ACLF）發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，NLR 越高，ACLF發(fā)生率越高，患者預(yù)后越差，故可作為慢性乙肝疾病進(jìn)展、炎癥反應(yīng)的評(píng)估指標(biāo)。因此本研究通過(guò)檢測(cè)慢性乙肝肝硬化患者體內(nèi)25-羥維生素D、NLR 水平，探究其在疾病中的表達(dá)意義，并分析其與Child-Pugh 評(píng)分、終末期肝病模型（MELD）評(píng)分的關(guān)系。同時(shí)研究?jī)烧咧g相關(guān)性，為肝硬化的治療提供新的思路及依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取錦州市中心醫(yī)院2018 年9 月至2020 年6月入院的乙肝肝硬化患者90 例作為實(shí)驗(yàn)組，要求患者住院信息完整，同時(shí)選取體檢中心同期健康體檢者70 例作為對(duì)照組。再將實(shí)驗(yàn)組根據(jù)Child-Pugh 分為Child-Pugh A 級(jí)、B 級(jí)、C 級(jí)三組；根據(jù)MELD 評(píng)分分為A、B、C 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)組患者均被明確診斷為乙型肝炎肝硬化，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2015 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》［7］中的診斷依據(jù)：①病因?qū)W明確的HBV 感染證據(jù)；②組織學(xué)或臨床提示肝硬化的證據(jù)。排出標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、酒精性肝病、自身免疫性肝病等；②急慢性細(xì)菌及病毒感染；③血液系統(tǒng)疾病；④急性心腦血管事件；⑤甲狀腺及甲狀旁腺疾病；⑥正在服用鈣劑或維生素藥物以及影響維生素D 代謝藥物（抗癲癇藥、糖皮質(zhì)激素）；⑦妊娠及哺乳期婦女。所有患者及家屬均簽署知情同意書(shū)，該研究獲倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 相關(guān)定義

1.2.1 MELD 評(píng)分計(jì)算公式 MELD=3.78×ln（總膽紅素mg/dL）+11.2×ln（INR）+9.57×ln（血肌酐mg/dL）+6.43（膽汁性或酒精性肝硬化為0，其余1）計(jì)算結(jié)果取整數(shù)，任何小于1 的數(shù)值默認(rèn)為1，以防評(píng)分為負(fù)數(shù)；適用于≥12 歲的患者。結(jié)果范圍：MELD 評(píng)分≥18 分，高危；MELD 評(píng)分14～18 分，中危；MELD 評(píng)分≤14 分，低危［8］。

1.2.2 Child-Pugh 評(píng)分 Child-Pugh 評(píng)分分級(jí)，A級(jí)：5～6 分；B 級(jí)：7～9 分；C 級(jí)：≥10 分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表1。

表1 Child-Pugh 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 維生素D水平分組 維生素D水平分為4個(gè)等級(jí)：正常（>30 ng/mL）、不足（20～30 ng/mL）、缺乏（10～20 ng/mL）、嚴(yán)重缺乏（<10 ng/mL）。

1.3 研究方法

記錄納入患者的一般資料，包括年齡、性別、體重指數(shù)（BMI）等。所有患者于入組后清晨空腹抽取外周靜脈血15 mL，2 h 內(nèi)送至檢驗(yàn)科，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中白蛋白（ALB）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）、肌酐（Cr）含量；采用全自動(dòng)凝血分析儀檢測(cè)凝血酶原時(shí)間（PT），國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）；采用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢查白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（Neu）及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（LYM），計(jì)算NLR。應(yīng)用羅氏全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，使用羅氏公司配套試劑，對(duì)受檢者的25-羥維生素D 水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位間距）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；多組間比較運(yùn)用單因素方差分析，兩組間進(jìn)行LSD、SNK 比較；計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)；用Spearman 法對(duì)25-羥維生素D、NLR與肝功能Child-Pugh 評(píng)分、MELD 評(píng)分、25-羥維生素D 水平與NLR 進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組基本資料與相關(guān)指標(biāo)比較

兩組受試者中年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組AST、ALT、PT、TBIL、Cr、NLR、INR 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；BMI、ALB、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、25-羥維生素D 低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組基本資料與相關(guān)指標(biāo)比較

2.2 Child-Pugh 評(píng)分、MELD 評(píng)分中25-羥維生素D 水平、NLR 比較

根據(jù)肝功能Child-Pugh 評(píng)分將實(shí)驗(yàn)組分為A級(jí)、B 級(jí)、C 級(jí)，隨著肝功能分級(jí)的增高，25-羥維生素D 水平降低、NLR 升高，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同Child-Pugh 評(píng)分中25-羥維生素D 水平、NLR 比較（）

表3 不同Child-Pugh 評(píng)分中25-羥維生素D 水平、NLR 比較（）

根據(jù)終末期肝病模型MELD 評(píng)分將實(shí)驗(yàn)組分為A、B、C 三組，其中MELD 評(píng)分≤14 分為A組；MELD 評(píng)分14～18 分為B 組；MELD 評(píng)分≥18分為C 組，比較三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)，隨著MELD評(píng)分升高，25-羥維生素D 水平降低、NLR 升高，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 不同MELD 評(píng)分中25-羥維生素D 水平、NLR 比較（）

表4 不同MELD 評(píng)分中25-羥維生素D 水平、NLR 比較（）

2.3 25-羥維生素D 水平、NLR 與Child-Pugh 評(píng)分、MELD 評(píng)分相關(guān)性分析

運(yùn)用Spearman 相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)25-羥維生素D 與肝功能Child-Pugh 評(píng)分、MELD 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)；NLR 與肝功能Child-Pugh 評(píng)分、MELD 評(píng)分呈正相關(guān)；NLR 與25-羥維生素D 水平呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)圖1。

圖1 25-羥維生素D 水平、NLR 與Child-Pugh 評(píng)分、MELD 評(píng)分相關(guān)性分析

3 討論

肝硬化是一種或多種原因引起的彌漫性進(jìn)行性慢性肝損害。在我國(guó)，目前引起肝硬化的病因以乙肝病毒性肝炎為主。乙肝肝硬化患者由于HBV 感染的持續(xù)存在，可導(dǎo)致人體免疫功能失調(diào)，此時(shí)淋巴細(xì)胞無(wú)法精準(zhǔn)分辨正常細(xì)胞與非正常細(xì)胞，從而導(dǎo)致肝臟產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，晚期肝硬化可被視為是炎癥綜合征的結(jié)果。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)升高的NLR 與肝炎、肝硬化肝癌密切相關(guān)，NLR 對(duì)于評(píng)估肝硬化病情進(jìn)展具有重要意義，包括代償期肝硬化、失代償期肝硬化和終末期肝硬化患者［9-12］。ZHANG 等［4］證明了升高的NLR 與HBV 相關(guān)失代償期肝硬化的嚴(yán)重性相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)其1 個(gè)月死亡的標(biāo)志。梁利民等［13］研究發(fā)現(xiàn)，NLR≥3.52是預(yù)測(cè)肝硬化患者1 年內(nèi)死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究發(fā)現(xiàn)乙肝肝硬化患者體內(nèi)NLR 高于健康對(duì)照組；且隨著Child-Pugh、MELD 評(píng)分級(jí)別升高，NLR 顯著升高，與上述評(píng)分呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明NLR 與乙肝肝硬化患者疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，這與上述研究結(jié)果基本一致。目前關(guān)于NLR 比值在乙肝肝硬化的發(fā)展中作用機(jī)制尚不明確，但有研究表明NLR 可能與肝臟“二次打擊學(xué)說(shuō)”有關(guān)，HBV 能夠促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，尤其誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向肝細(xì)胞匯集，進(jìn)一步損傷肝臟，且終末期肝病患者體內(nèi)劇烈炎癥反應(yīng)可以導(dǎo)致淋巴細(xì)胞大量凋亡，使存集于肝細(xì)胞內(nèi)的中性粒細(xì)胞釋放血，使NLR 水平升高［14-15］。

近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)25-羥維生素D 水平在慢性乙肝患者體內(nèi)普遍降低，其中肝硬化患者降低更甚，說(shuō)明維生素D 的缺乏與慢性肝病進(jìn)展及肝衰竭嚴(yán)重程度密切相關(guān)，有可能成為評(píng)估其預(yù)后的重要指標(biāo)。REITER［16］等通過(guò)研究硬化性膽管炎小鼠，發(fā)現(xiàn)25-羥維生素D 可下調(diào)腫瘤壞死因子受體1 和CD11b4細(xì)胞的表達(dá)，改善肝臟炎癥損傷，延緩肝纖維化進(jìn)程。SUNEETHA 等［17］研究發(fā)現(xiàn)維生素D3 受體（VDR）基因多態(tài)性是HBV 感染的關(guān)鍵宿主因素，與HBV 患者易感性、病毒持續(xù)感染及疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，25-羥維生素D 水平在乙肝肝硬化患者中水平較健康對(duì)照組低，且隨著Child-Pugh 評(píng)分、MELD 評(píng)分升高，25-羥維生素D 水平降低，與上述評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）證明乙肝肝硬化患者維生素D 缺乏程度與疾病進(jìn)展及肝功能嚴(yán)重程度相關(guān)，25-羥維生素D 可作為評(píng)估肝硬化病情的重要指標(biāo)。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，25-羥維生素D在免疫與炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，它可以通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞周期蛋白及I 型膠原蛋白等的表達(dá)發(fā)揮抗纖維效應(yīng)［18］，亦可通過(guò)介導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用抑制炎癥［19］。目前已知VDR 和1α 羥化酶在中性粒細(xì)胞均有表達(dá)，這表明25-羥維生素D 可能影響著中性粒細(xì)胞的分化、生物合成活性和它的功能［20］。ZHU 等［21］通過(guò)對(duì)長(zhǎng)期缺乏維生素D 膳食的成年小鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其血液中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素10（IL-10）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎癥介質(zhì)升高，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、金屬蛋白酶-13（MMP-13）等纖維化指標(biāo)也顯著增高，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡因子Fas、Fas 配體（FasL）水平增高，而B(niǎo)cl2、Bclx表達(dá)降低，從而證實(shí)了維生素D 缺乏可導(dǎo)致機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)，增加細(xì)胞程序性死亡。在本研究中發(fā)現(xiàn)，乙肝肝硬化患者體內(nèi)25-羥維生素D 水平與NLR 呈負(fù)相關(guān)，NLR 水平升高反映了該病的炎癥負(fù)擔(dān)，可能因?yàn)榫S生素D 缺乏，導(dǎo)致肝臟炎癥和纖維化的加重，兩者共同參與肝硬化的發(fā)生發(fā)展。然而，本研究存在一定局限性，樣本量小，納入患者存在偏移，而且只探討了一個(gè)炎癥指標(biāo)，應(yīng)對(duì)聯(lián)合更多的炎癥指標(biāo)進(jìn)行深入探討，研究25羥-維生素D 與肝臟炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。

綜上所述，25-羥維生素D 的缺乏，以及NLR的升高均可加重乙肝肝硬化患者的肝臟損傷稱度，其中25-羥維生素D 缺少在一定程度上介導(dǎo)肝臟的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致NLR 升高。在臨床上，NLR、25-羥維生素D 可作為評(píng)估肝臟病變嚴(yán)重程度的指標(biāo)，適當(dāng)補(bǔ)充維生素D 可延緩肝病發(fā)展進(jìn)程，但需要更多的研究、大數(shù)目的樣本量以及長(zhǎng)期隨訪。