阿魏酸鈉通過ERK信號通路干預大鼠心肌缺血再灌注損傷的實驗研究

張博倫，王麗，胡雅光，林富，盧德永

（錦州醫科大學附屬第三醫院，遼寧 錦州 121000）

急性心肌梗死（AMI）是缺血性心臟疾病中導致人類死亡的重要因素。目前，心臟血管的再通技術仍是治療AMI 的最有效和最直觀方法，血管生成治療是治療缺血性心肌病的主要手段［1］，如心臟搭橋手術或經皮冠脈介入術（PCI）。心肌缺血治療最重要的是側支循環的建立［2］，然而心肌缺血再灌注損傷（MIRI）嚴重影響心臟病患者的治療效果及預后心肌損傷的惡化。

阿魏酸鈉（SF）可以通過ERK1/2 信號途徑上調血管內皮生長因子（VEGF）蛋白，進而促進血管新生，增加缺血、缺氧心肌的側枝循環，提高心肌細胞存活率，降低AMI 患者的病死率。目前通過應用VEGF 蛋白、VEGF 基因上調VEGF 治療心肌缺血存在局限性，因此根據VEGF 促進血管生成的作用機制，尋找從多靶點、多環節干預VEGF 生成的藥物具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD 大鼠40 只，200～230g。將大鼠適應性飼養1 周后，隨機分為假手術組（Sham組）、模型組（MI/R 組）、阿魏酸鈉組（SF 組）、SF+ERK1/2 抑制劑組（In 組），每組10 只。Sham組、MI/R 組均每日1 次腹腔注射2 mL 生理鹽水，SF 組每日1 次腹腔注射SF（40mg/kg）用生理鹽水稀釋成2 mL 的液體，In 組每日1 次腹腔注射SF（40 mg/kg）+U0126（10 μmol/L）用生理鹽水稀釋成2 mL 液體。2 周后造模：術前禁食12 h、稱重，10%水合氯醛腹腔麻醉，氣管插管，四肢皮下組織插入針形電極，接心電監護儀、心電圖機，記錄標準Ⅱ導聯的心電圖。胸部去毛、消毒，沿胸骨左側旁行切口，剪斷第3～4 根肋骨，輕壓右胸腔，充分暴露心臟；在肺動脈圓錐與左心耳間分離出左冠狀動脈前降支，除Sham 組只開胸不結扎外，其余各組在左前降支發出1～2 mm 處結扎，結扎30 min 后、再灌注120min，即為缺血-再灌注損傷模型。以心電圖改變作為缺血再灌注造模成功的標志：結扎左前降支后見心電圖Ⅱ導聯ST 段抬高，增寬；再灌注時抬高的ST 段回落>50%［3］。造模后每只大鼠腹腔注射青霉素8 萬U抗感染，連續應用3 d，分別于12 h 后尾靜脈取血，1 周后處死大鼠，取心臟組織。

1.2 觀察指標

1.2.1 血漿心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）濃度 大鼠尾靜脈取血于（加抗凝劑）試管中，離心（3 000 r/min）提取血漿，于-4℃冰箱中暫時保存。全自動生化分析儀上檢測血漿cTnⅠ，估測心肌損傷程度；血漿NT-proBNP 估測心功能。

1.2.2 免疫組織化學法檢測心肌中VEGF 及微血管密度（MVD）的表達 取10%甲醛固定梗死周邊缺血區心肌組織，并進行常規石蠟包埋及作心肌切片（5 μm），在400 倍視野下分別檢測VEGF蛋白質、MVD 的表達，MVD 用CD31 陽性表達結果表示：細胞胞漿顏色呈棕黃色染色為陽性，隨后測定平均光密度值并作半定量分析。

1.2.3 Western blotting 方法檢測心肌p-ERK1/2 信號蛋白 通過心肌蛋白的提取、轉模及雜交、反復洗膜后，將膜與適當比例稀釋后的一抗（t-ERK1/2、p-ERK1/2 兔抗均1∶500）4℃孵育過夜，再次反復洗模后，把模放入裝有二抗的離心管中，室溫輕搖1.5 h、洗膜，用Western blotting 顯跡；同時用抗體ERK1/2（1∶500）作為內參照，分別用不加ERK1/2 抗體作為陰性對照。

1.2.4 心肌梗死面積的測定 實驗結束后，每組隨機取4 只心臟，沖洗殘余血液后，沿冠狀溝剪去心房及各大血管，留取心室組織、稱重；然后平行于冠狀溝將心室肌切成4～5 片、厚約1 mm，置于0.05%濃度的NBT 溶液中，37℃恒溫水浴振搖染色15 min，直至正常心肌染為深紫色。梗死區心肌區域未著色為淡紅色取出，沖洗組織后、微距拍照，3 倍放大洗像。采用BI2000 圖象分析系統計算左心室面積、梗死區面積，梗死范圍表示為梗死區心肌面積占全心室面積的百分比。

1.2.5 心肌組織病理學改變 實驗結束后取出心臟，立即將50 mL 固定液注入離體心臟主動脈內，5 min 后將左心室前壁心肌組織中間層切成條狀，放在上述固定液中2 h；然后在0.09 mol KH2P04（7.5%蔗糖，pH 值7.4）中漂洗15 min，并在此溶液中保存。依次常規酒精逐級脫水、二甲苯透明、常規石蠟包埋，間斷均勻切片，切片均為5mm 厚做蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察心肌細胞組織學結構改變。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA）、SNK 檢驗，病理形態學資料用對比描述分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4 組血漿cTnⅠ、NT-proBNP 水平比較

與Sham 組比較，其余各組血漿cTn Ⅰ、NT-proBNP 水平升高，差異有統計學意義（P<0.05），說明各組大鼠心肌細胞發生了不同程度的損傷，其中MI/R 組損傷最嚴重。與MI/R 組比較，SF 組cTnⅠ、NT-proBNP 濃度降低，差異有統計學意義（P<0.05），說明給予SF 預處理后，大鼠心肌細胞損傷程度降低。與SF 組比較，加入ERK1/2 抑制劑U0126 后，cTnⅠ、NT-proBNP 濃度升高，差異有統計學意義（P<0.05），表明ERK1/2 信號通路抑制劑抑制SF 對心肌組織的保護作用。見表1。

表1 4 組血漿cTnⅠ、NT-proBNP 水平比較（n=10,）

表1 4 組血漿cTnⅠ、NT-proBNP 水平比較（n=10,）

2.2 4 組心肌組織VEGF 蛋白及MVD 的變化比較

與Sham 組比較，MI/R 組心肌組織中VEGF蛋白增加，差異有統計學意義（P<0.05），提示在缺血、缺氧狀態下VEGF 蛋白反應性增加。與MI/R組比較，SF 組心肌組織VEGF 蛋白增加，差異有統計學意義（P<0.05），提示SF 可以增加VEGF蛋白的生成；加入U0126 抑制劑后，In 組心肌組織VEGF 蛋白下降，差異有統計學意義（P<0.05），表明SF 促進VEGF 的生成與ERK1/2 信號通路密切相關。見圖1、2。

圖1 免疫組織化學方法所示，4 組VEGF 蛋白陽性表達結果（×400）

2.3 4 組CD31 陽性表達結果比較

圖2 4 組VEGF 蛋白陽性表達結果（n=10,）

與Sham 組比較，其余各組心肌組織CD31 陽性表達減少，差異有統計學意義（P<0.05），提示因缺血、缺氧導致心肌組織微血管密度降低。與MI/R 組比較，SF 組心肌組織CD31 陽性表達增加，差異有統計學意義（P<0.05），提示SF 可以增加微血管密度的生成；加入U0126 抑制劑后，In 組心肌組織CD31 陽性表達下降，差異有統計學意義（P<0.05），表明SF 促進微血管生成的作用與ERK1/2 信號通路密切相關。見圖3、4。

圖3 免疫組織化學方法所示，4 組CD31 陽性表達結果（×400）

圖4 4 組CD31 陽性表達結果（n=10,）

2.4 4 組心肌組織p-ERK1/2 信號蛋白變化比較

實驗結果顯示，與Sham 組比較，其余各實驗組心肌組織p-ERK1/2 信號通道蛋白增加，差異有統計學意義（P<0.05），這與VEGF 蛋白增加呈明顯的相關趨勢。與MI/R 組比較，SF 組的心肌組織p-ERK1/2 信號通道蛋白增加，差異有統計學意義（P<0.05）。加入U0126 抑制劑后p-ERK1/2 信號通道蛋白減少，差異有統計學意義（P<0.05），這表明通過U0126 抑制劑的作用，In 組p-ERK1/2 信號通道蛋白表達被抑制。通過上述實驗表明，心肌組織VEGF 蛋白、p-ERK1/2 信號蛋白表達呈正相關性（P<0.05）。見圖5、6。

圖5 4 組p-ERK1/2 信號蛋白的表達（n=10,）

圖6 4 組心肌組織p-ERK1/2 信號通道蛋白、t-ERK1/2蛋白表達

2.5 4 組大鼠心肌梗死面積比較

與Sham 組比較，其余各組心肌組織梗死面積增加，差異有統計學意義（P<0.05）。與MI/R 組比較，SF 組心肌梗死面積減少，差異有統計學意義（P<0.05）；加入U0126 抑制劑后心肌組織梗死面積增加，差異有統計學意義（P<0.05）。SF 通過ERK1/2 信號通路減少MIRI，減少心肌細胞凋亡，預防心肌組織壞死，SF 對心肌組織的保護作用與ERK1/2 信號通道蛋白密切相關。見表2。

表2 4 組大鼠心肌梗死面積比較（n=10,,%）

表2 4 組大鼠心肌梗死面積比較（n=10,,%）

2.6 4 組心肌組織病理學改變

光學顯微鏡下形態學變化：Sham 組中心肌纖維、細胞核均勻排列，間質中無炎細胞浸潤；MI/R組和In 組中可見大量心肌纖維斷裂和間質中炎細胞浸潤，并見大量的核固縮、核碎裂；SF 組中心肌纖維斷裂減少，間質中少量炎細胞浸潤，清晰濃染的細胞核。見圖7。

圖7 4 組心肌組織病理形態學觀察（×400）

3 討論

AMI 的治療從最初的藥物治療發展到溶栓、經皮腔內冠狀動脈成形術、支架植入術、冠狀動脈旁路術、激光再通、心肌打孔等恢復血流再通，但是心肌缺血再灌注后出現的心律失常、無復流、心肌凋亡、壞死等情況反而加重了心肌損傷［4］。在缺血再灌注中，心肌梗死面積是影響心功能的主要原因，因此通過減少心肌梗死面積，增加心肌組織的血流供應是解決缺血再灌注損傷的有效途徑之一［5］。

血管生成被認為是心肌組織缺血、缺氧后的一種適應性反應，同時其在治療缺血性疾病中被認為是一個靶向目標，其中就包括通過改善微循環治療心肌缺血［6-7］。VEGF 是血管生成因素之一，參與了血管生成的所有階段，包括血管的生成發芽、不成熟的新生血管新芽的穩定、成熟的生理血管生成［6］。VEGF 通過誘導血管生成恢復心肌的血液供應，保護左心室功能和預防左心室重構，降低死亡率［8］。多項研究表明，PI3K/Akt 信號通路和MAPK/ERK 信號通路可以通過介導轉錄因子HIF-1a 誘導VEGF 表達［9-10］，其中ERK1/2 途徑涉及多種細胞功能，包括細胞存活、細胞凋亡和增殖。

SF 是桂皮酸的衍生物之一，活血化淤是其主要功能，可有效抑制血管內皮素的分泌，促進一氧化氮的生成，具有抗血小板活性、抑制血小板5-羥色胺釋放、抗氧化、清除自由基和調節血管舒縮、保護血管內皮功能等多種藥理作用。SF 可以有效降低冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者的血脂水平，其促進血液流動，增加冠狀動脈血流量，緩解血管平滑肌痙攣，改善心肌供血和預防心肌梗死的發生，應當成為臨床預防和治療該病的重要用藥選擇。然而國內外對其在MIRI 中對VEGF的影響方面的研究報道較少，本課題采用SF 預處理SD 大鼠模型，檢測大鼠心肌組織MIRI 指標，觀察SF 對大鼠急性心肌缺血再灌注后心肌組織、VEGF 蛋白、微血管密度及ERK1/2 信號通路相關蛋白表達的影響，探討其對MIRI 的保護作用及可能機制，為防治MIRI 提供新思路。

本研究結果發現，SF 組與In 組比較，cTnⅠ、NT-proBNP 水平降低，比較有差異；與MI/R 組比較降低更加顯著，比較亦有差異，說明應用SF 預處理后MIRI 程度減輕，保護和改善了左室心肌功能，減少了心肌梗死面積。與Sham 組比較，MI/R組VEGF 蛋白表達增加，表明心肌組織在缺血、缺氧狀態下VEGF 適應性增加，而CD31 陽性表達的下降又表明VEGF 的水平并不能有效促進微血管生成，達到減少MIRI 目的。與MI/R 組比較，SF 組VEGF 蛋白和CD31 陽性表達均有顯著增高，說明SF 預處理可明顯上調VEGF 蛋白的表達水平，并起到了促進微血管的生成、降低MIRI 的程度，具有改善心功能的作用。與SF 組比較，加入ERK1/2 特異性抑制劑U0126 后，p-ERK1/2 信號蛋白表達下降，同時伴隨著VEGF 蛋白與CD31 陽性表達的降低，這進一步說明ERK1/2 信號通路參與了VEGF 促進微血管生成的過程。

本研究結果表明：①SF 在MI/RI 時，通過上調VEGF 介導I/R 過程中的心臟保護作用；②SF對I/R 心肌的保護機制與增加微血管生成、改善微循環有關；③SF 在I/RI 時的心臟保護作用機制，可能與ERK1/2 信號通路有關。

AMI 后的心肌組織血液供應急劇下降，壞死心肌組織參與心室重構并加重心力衰竭，通過增加微循環改善缺血心肌的血液供應，預防性的避免心肌組織損傷的進一步加重，是目前治療心肌缺血最有效和最直觀的途徑。缺血心肌通過VEGF增加血管生成、改善微循環，進而改善心臟射血功能是目前臨床治療重要的突破口。應用VEGF蛋白、VEGF 基因增加血管生成，改善心肌缺血側枝循環功能是可行的，但是須有臨床大樣本及更長時期的研究觀察。在當前治療心血管疾病的藥物中發現更多有利于改善心肌功能、增加新生血管形成的藥物，以便為臨床藥物的應用提供更有力的證據。

綜上所述，VEGF 通過增加微血管生成、改善心肌組織血供、降低MIRI。SF 可以通過ERK1/2信號通路上調VEGF 蛋白，進而增加微血管生成，起到保護大鼠MIRI 的作用。