人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法的建立

劉曉玉，施 萍，潘伯臣*，龐希寧2,*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心,遼寧 沈陽 110004；2.中國醫(yī)科大學(xué) 干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究室,遼寧 沈陽 110122；3.沈陽艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司,遼寧 沈陽 110015)

間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新，多向分化潛能及旁分泌作用，是組織工程重要的種子細(xì)胞[1]。人羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human amnion mesenchymal stem cells，hAMSCs)取材于臨床廢棄的羊膜組織，同時(shí)具備易獲得、可塑性強(qiáng)、低免疫原性、無倫理約束等優(yōu)勢(shì)，使其成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2]，是臨床上進(jìn)行組織修復(fù)最理想的細(xì)胞選擇，已有報(bào)道利用hAMSCs修復(fù)皮膚創(chuàng)傷，能夠降低炎性反應(yīng)，加速創(chuàng)傷愈合，同時(shí)減少瘢痕形成[3]。

hAMSCs大量培養(yǎng)擴(kuò)增是其臨床應(yīng)用的前提條件。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境是影響細(xì)胞增殖狀態(tài)及臨床應(yīng)用效果的重要因素[4-5]，體外細(xì)胞培養(yǎng)最常使用胎牛血清，而胎牛血清中含有大量未知的成分包括生長(zhǎng)因子，免疫活性物質(zhì)，等等，易引起免疫反應(yīng)，具有一定的臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)。因此，hAMSCs培養(yǎng)條件的安全性和標(biāo)準(zhǔn)化問題亟待解決[6-7]。本研究旨在建立一種hAMSCs的無動(dòng)物源性成分培養(yǎng)方法，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人羊膜組織(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)科)，該研究經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：AF-SOP-07-1.0-01)，并且已經(jīng)過患者知情同意。胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司)；兩性霉素B、膠原酶、抗壞血酸(L-ascorbic acid)(Sigma-Aldrich公司)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(Peprotech公司)；胰島素(1 g/L)-轉(zhuǎn)鐵蛋白(0.55 g/L)-亞硒酸鈉(0.000 67 g/L)(insulin-transferrin-selenium，ITS)和胰蛋白酶(Gibco公司)；抗-CD90、-CD73、-CD34和-CD45抗體(Biolegend公司)，WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(WST-1 Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit，上海碧云天生物公司)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 hAMSCs的分離培養(yǎng)：取健康剖宮產(chǎn)羊膜，用冷0.9%氯化鈉溶液清洗血跡，去除絨毛膜后剪切，取面積大小約25 cm2羊膜，置于含100 U/mL青鏈霉素及2.5 μg/mL兩性霉素B的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)中浸泡20 min。取出剪碎后加入0.25%的胰蛋白酶，于37 ℃消化30 min；終止消化后清洗，1 mg/mL的Ⅳ型膠原酶37 ℃消化1 h；終止消化后細(xì)胞篩過濾，加入含有10% FBS，10 ng/mL bFGF，10 ng/mL EGF，100 U/mL青鏈霉素 及 2.5 μg/mL兩性霉素B的 DMEM/F12培養(yǎng)基中[7]，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。接種后24 h進(jìn)行換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，達(dá)80%匯合時(shí)消化傳代，加入DMEM/F12(含 1×ITS、0.5%人血清白蛋白、10 ng/mL bFGF、100 μg/mL L-ascorbic acid、100 U/mL青鏈霉素及2.5 μg/mL兩性霉素B)的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 免疫熒光法檢測(cè)鑒定hAMSCs：將處理好的蓋片置入6孔板內(nèi)，按2 × 105個(gè)/mL將ITS無血清培養(yǎng)的hAMSCs接種于蓋片上。當(dāng)hAMSCs達(dá)到70%～80%匯合時(shí)，利用4%多聚甲醛室溫固定15 min，1 × PBS 洗滌后1% 牛血清白蛋白室溫封閉30 min，一抗 (抗-CD90、-CD73、-CD34或-CD45抗體)孵育4 ℃ 過夜，1×PBS洗滌后二抗室溫孵育1 h，DAPI染色，95%甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 WST-1檢測(cè)細(xì)胞增殖：將ITS無血清培養(yǎng)的hAMSCs胰蛋白酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，以2 000個(gè)/孔濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，第2天開始每天于同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法：棄去培養(yǎng)液，PBS洗后更換新鮮培養(yǎng)液100 μL，然后每孔加入10 μL的WST-1，并在37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～3 h；取出細(xì)胞后，選擇450 nm波長(zhǎng)讀取吸光度(A)值。然后以細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以450 nm波長(zhǎng)吸光度值為縱坐標(biāo)繪制連續(xù)檢測(cè)7 d后的細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4 細(xì)胞劃痕傷口閉合試驗(yàn)：當(dāng)6孔板接種的ITS無血清培養(yǎng)的hAMSCs達(dá)90%匯合時(shí)，用200 μL槍頭垂直于細(xì)胞單層上劃十字形劃痕，力度以剛好能劃落細(xì)胞而不在培養(yǎng)板上留下劃痕為標(biāo)準(zhǔn)。PBS清洗后加入ITS培養(yǎng)液，于48 h后觀察劃痕的愈合情況。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)生長(zhǎng)因子的表達(dá)：ITS培養(yǎng)液培養(yǎng)的hAMSCs達(dá)到90%匯合后按照Trizol的試劑說明書提取總RNA，NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的A值及比值，以確定RNA的濃度及純度。再按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑說明書混樣，在ABI7500儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，PCR反應(yīng)體系為25 μL，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH的表達(dá)量作為內(nèi)參，計(jì)算目的基因的表達(dá)量，計(jì)算方法為2-ΔΔCt相對(duì)定量法。PCR引物見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primers for qPCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征

原代分離培養(yǎng)的hAMSCs，加入ITS培養(yǎng)基，接種3 d后呈現(xiàn)短梭形，7 d后開始伸展，呈魚群樣排列，接種10 d達(dá)到 90% 匯合(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察無血清培養(yǎng)的hAMSCsFig 1 Observtion of hAMSCs culturing in serum free medium by inverted microscope(×40)

2.2 免疫熒光鑒定

免疫熒光可見大部分 hAMSCs 表達(dá) CD90 和 CD73，不表達(dá) CD45和CD34(圖2)。

圖2 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)無血清培養(yǎng)的hAMSCs細(xì)胞表面CD34、CD45、CD73和CD90的表達(dá)Fig 2 Immunofluorescence assay was used to detect the expression of CD34,CD45,CD73 and CD90 on the surface of hAMSCs cultured in serum free medium

2.3 細(xì)胞增殖曲線

繪制ITS無血清培養(yǎng)的P3-P6的hAMSCs細(xì)胞增殖曲線(圖3)。第1～2天，細(xì)胞增殖速度緩慢，接種后培養(yǎng)第3～4 天處于細(xì)胞的快速增殖期，接種后培養(yǎng)第5天進(jìn)入增殖平臺(tái)期。

圖3 hAMSCs細(xì)胞增殖曲線Fig 3 Cell growth curves of hAMSCs

2.4 細(xì)胞劃痕傷口閉合試驗(yàn)

ITS培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，與FBS培養(yǎng)條件下相比，hAMSCs的遷移能力增強(qiáng)，遷移速度加快(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with FBS group圖4 ITS無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的hAMSCs遷移能力增強(qiáng)Fig 4 hAMSCs cultured in ITS serum free medium had a significant increase in cell migration ability compared with

2.5 生長(zhǎng)因子的表達(dá)

VEGF、KGF、PDGF和IGF-1與FBS對(duì)照組相比，ITS組生長(zhǎng)因子表達(dá)上調(diào)(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with FBS group圖5 RT-qPCR檢測(cè)ITS無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的hAMSCs生長(zhǎng)因子的表達(dá)Fig 5 RT-qPCR assay was used to detect the expression of growth factors of hAMSCs cultured in ITS serum-free medium compared with FBS

3 討論

干細(xì)胞治療是目前科學(xué)研究的熱點(diǎn)，具有很大的臨床應(yīng)用潛能。但同時(shí)也涉及一些實(shí)際問題，如安全性，倫理道德問題，因而其應(yīng)用受到限制。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用具有很多優(yōu)勢(shì)[8]，羊膜的供給不受限制且與脂肪和骨髓相比獲取更便利。羊膜來源細(xì)胞的增殖和分化潛能超過脂肪組織，比其他母體來源的細(xì)胞分化能力更強(qiáng)。而且胎兒來源的細(xì)胞能排除成體來源細(xì)胞因年齡引起的增殖分化能力下降的問題。根據(jù)需要羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞可以于胎兒出生后，分離并儲(chǔ)存，以備將來需要自體移植時(shí)可以立刻提供。本實(shí)驗(yàn)研究，通過胰蛋白酶和膠原酶消化分離培養(yǎng)的hAMSCs，細(xì)胞得率高，增殖能力較強(qiáng)，P3代以后的細(xì)胞形態(tài)均一，呈典型的長(zhǎng)梭形，魚群樣排列，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物CD73和CD90，不表達(dá)CD34和CD45。

細(xì)胞為基礎(chǔ)的再生治療需要將細(xì)胞在體外培養(yǎng)之后移植到靶組織。隨著越來越多的細(xì)胞治療課題從實(shí)驗(yàn)室階段發(fā)展到臨床前或臨床階段，無異種蛋白的培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)于hAMSCs體外培養(yǎng)越來越重要。這種培養(yǎng)體系的重要性在于能避免免疫排斥，跨種系感染的風(fēng)險(xiǎn)以及對(duì)細(xì)胞功能的改變，避免與非人源細(xì)胞培養(yǎng)成分有關(guān)的基因表達(dá)。ITS混合成的混合物已經(jīng)用于很多類細(xì)胞的增殖和分化，業(yè)已證實(shí)，胰島素的促有絲分裂和代謝作用，并且胰島素對(duì)于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)也是至關(guān)重要的。轉(zhuǎn)鐵蛋白是鐵的載體，有助于降低非蛋白結(jié)合鐵產(chǎn)生的氧毒性。硒是一種微量元素，通過其在硒蛋白中的結(jié)合形式(谷胱甘肽過氧化物酶，硫氧還蛋白還原酶及硒蛋白)而作為培養(yǎng)基中的抗氧化劑[6-7]。本研究利用ITS結(jié)合人血清白蛋白對(duì)hAMSCs進(jìn)行大量培養(yǎng)擴(kuò)增，通過觀察ITS培養(yǎng)條件下hAMSCs增殖和遷移能力，以及生長(zhǎng)因子的表達(dá)，評(píng)估其作為無血清培養(yǎng)添加劑的臨床應(yīng)用潛能[9-10]。結(jié)果證明，ITS培養(yǎng)環(huán)境不改變hAMSCs的表型，能夠維持hAMSCs的增殖和遷移能力及生長(zhǎng)因子的表達(dá)，可以作為hAMSCs臨床應(yīng)用前的無血清培養(yǎng)基。