上調miR-433表達抑制結直腸癌細胞系增殖

張 劍，張 彤，王宏偉，張繼紅，張保禎，董欣敏

(內蒙古醫科大學附屬醫院 1.放療科；2.普外科，內蒙古 呼和浩特 010050；3.內蒙古醫科大學附屬人民醫院 腫瘤內科，內蒙古 呼和浩特 010010)

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，全世界每年的新診病例可達136萬，病死率居惡性腫瘤的第4位[1]。中國結直腸癌發病率、病死率盡管處于非高發水平，但其發病總例數及死亡總例數均高居世界第1位，且仍逐年上升[2]。微RNA(microRNAs,miRNAs)是一類非編碼、內源性、長度19～25個堿基的小分子RNA，通過對3′非編碼區的3′-UTR特異結合，與多種mRNA發生反應，通過不完全互補反應以抑制mRNA翻譯，通過完全互補反應以促進mRNA降解，調控、誘導多種編碼蛋白質的基因表達，從而參與機體幾乎所有細胞的增殖、分化、凋亡等生命活動[3]，并參與腫瘤細胞增殖、血管生長，或在遠處臟器構建利于轉移的微環境，進一步誘導腫瘤細胞發生轉移、侵襲[4]。miR-433是位于第12號染色體的編碼基因，研究表明其高表達可以抑制細胞的遷移、增殖和分化，與腫瘤的發生呈負相關[5]；胃癌、肝癌中miR-433作為抑癌基因存在，而其高表達與漿液性卵巢癌不良進展預后亦高度相關[6]。但目前尚缺乏miR-433與結直腸癌侵襲、轉移的相關研究，本研究擬分析miR-433在結直腸癌中表達狀況及miR-433對結直腸癌發生、發展過程中的影響以及二者的相關性，以期尋找結直腸癌新的靶向治療方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及試劑：人類結腸癌細胞系(HT-29、HCT-116和SW480)、人正常結直腸黏膜細胞系(NCM460)(中國細胞庫)。

實時定量PCR試劑盒、RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；碘化丙啶、Giemsa(Sigma-Adrich公司)；CCK-8試劑盒(同仁化學研究所)；細胞轉染試劑、miR-433模擬物(上海吉瑪生物有限公司)；細胞培養基及血清(Gibco公司)。

1.1.2 入組人群和組織樣本：獲取2018年5月至2019年6月收治的125例結直腸癌患者的組織樣本檢測miR-433表達。其中女52例、男73例，平均年齡(47.8±10.5)歲；所有納入對象心、肝、腎、骨髓功能正常。病理學診斷為結直腸癌患者且接受了手術切除治療；排除標準：家族性腺瘤息肉病、遺傳性非息肉病性結直腸癌、多個病灶的原發癌，以及術前接受放療或化療、新輔助治療的患者。第1組：結直腸癌患者的癌組織樣本、癌旁組織樣本和癌病灶遠端的正常結直腸黏膜,第2組：Ⅰ～Ⅳ 期(根據UICC分期系統)結直腸癌患者樣本。組織樣本從手術室取得，清洗后并立即于液氮或-80 ℃冷凍儲存備用。本研究倫理委員會批準[WZ(2021023)]，患者均于參與本研究前簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR檢測mRNA：用RNA提取試劑盒從結直腸癌組織樣本和結直腸癌細胞中分離提取組織或細胞中的總RNA定量。定量后將提取到的總RNA使用PrimeScript RT試劑盒反轉錄成 cDNA，由此產生的cDNA在miR-433引物作用下，使用SYBR PCR反應混合液進行擴增。miR-433的相對量化水平應用2-ΔΔCt方法計算。

1.2.2 穩定和瞬時過表達miR-433結直腸癌細胞株的轉染：構建miR-433過表達載體，在結直腸癌細胞系中通過克隆含完整的miR-433 cDNA編碼區的DNA片段擴增到pcDNA3.1載體。用Lipofectamine2000將Pre-miR433瞬時轉染結腸癌細胞。用RT-qPCR驗證miR-433的轉染效率，U6作為內參進行評估。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖：采用細胞計數Kit-8評估腫瘤細胞增殖能力。miR-433轉染后的腫瘤細胞以5×103個/孔種植到96孔板。根據操作要求，48 h后細胞中加入CCK-8試劑孵育，于酶標儀下測定A值。計算細胞活性，計算公式：細胞相對活性=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.4 流式細胞測量術分析細胞周期：將腫瘤細胞接種到預先經4 ℃、18 h包被有10 μg/mL纖連蛋白的96孔板，經37 ℃、90 min孵育使細胞結合。孵育結束后，使用細胞計數Kit-8量化附著細胞。檢測miR-433轉染后細胞周期分布的變化，培養細胞并以miR-433 mimics 瞬時轉染48 h后用PI染色，以流式細胞術檢測細胞周期分布。

1.2.5 Transwell小室法檢測遷移和侵襲：將8 μm孔徑的半透膜放入24孔的細胞培養板。將培養的結直腸癌細胞按2×105個/mL加入到無血清條件的上室，室底部充滿了含有20%胎牛血清的細胞增殖基質，37 ℃孵育。24 h后非遷移的細胞仍然在隔膜的上表面層，可以被棉球檫掉，而遷移的細胞已移動到膜的下層并被冰冷的甲醇固定，用5% Giemsa 染色，在光學顯微鏡下隨機選取10個視野200倍放大計數，每個樣本重復計數3次。腫瘤細胞侵襲實驗用預先包被了基底膜基質的半透膜進行，其他步驟同上述細胞遷移實驗。

1.2.6 腫瘤細胞劃痕愈合實驗：培養細胞，用miR-433模擬物瞬時轉染48 h，進行劃痕愈合試驗。簡言之，腫瘤細胞形成單層細胞后，使用10 μL微量移液管劃一個傷口，然后用冰冷的PBS簡單的清洗細胞,進一步培養48～72 h。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-433在臨床標本中的相對表達

與癌旁組織相比，miR-433在結直腸癌組織CRC中表達顯著降低(P<0.05)(圖1A)。在結腸癌患者血清中miR-433水平也顯著低于健康人群(P<0.05)(圖1B)。從TNM Ⅰ期到Ⅳ期，結直腸癌組織內miR-433表達逐漸降低(P<0.05)(圖1C)。

A.miR-433 expression in rectal cancer and adjacent tissues，*P<0.05 compared with control group;B.miR-433 expression in serum of colorectal cancer patients and normal people,*P<0.05 compared with control group;C.miR-433 expression in different stages;*P<0.05 compared with TNM Ⅰ group；#P<0.05 compared with TNM Ⅱ group；△P<0.05 compared with TNM Ⅲ group圖1 miR-433在直腸癌組織和癌旁組織以及健康人群血清中的表達Fig 1 Expression of miR-433 in rectal cancer and adjacent tissues of patients and serum of normal population

2.2 miR-433在直腸癌系和正常細胞系的表達

與健康人結腸上皮細胞系NCM460相比，在結直腸癌細胞系HT-29、HCT-116、SW480中，miR-433表達下調(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with NCM460 group圖2 miR-433在直腸癌系和正常細胞系的表達Fig 2 Expression of miR-433 in rectal cancer cell lines and normal cell line

2.3 上調miR-433表達抑制SW480細胞系增殖

SW480轉染miR-433模擬物(圖3A)，與對照miRNA組相比，SW480細胞增殖水平明顯降低(P<0.05)(圖3B)。

A.miR-433 mimic transfection;B.the effect of miR-433 minic transfection on the proliferation of SW480；*P<0.05 compared with control group圖3 上調miR-433對SW480增殖的影響Fig 3 Effect of up-regulation of miR-433 on proliferation of SW480

2.4 上調miR-433表達誘導SW480細胞周期阻滯

SW480細胞轉染miR-433 mimic后，G2期和M期細胞明顯增加(P<0.05)(圖4)。

圖4 上調miR-433表達對SW480細胞周期阻滯的影響Fig 4 Effect of up-regulation of miR-433 on cell cycle arrest in SW480 cells

2.5 上調miR-433抑制SW480細胞侵襲與遷移

SW480具有較強的遷移能力。上調細胞內miR-433表達后，遷移能力顯著下降(P<0.05)(圖5A)；對照組以及對照miRNA組細胞均有明顯的侵襲穿透基質膠現象，轉染miR-433 mimic后，與對照miRNA組相比，穿膜數目明顯減少(P<0.05)(圖5B)(表1)。

A.effect of miR-433 on invasion;B.effect of miR-433 on migration圖5 miR-433對SW480細胞侵襲和遷移的影響Fig 5 Effect of miR-433 on invasion and migration of SW480 cells

表1 上調miR-433抑制細胞遷移與侵襲Table 1 Up-regulation of miR-433 decreased cells migration and invasion(%)

3 討論

人類編碼miRNA數千個，可調節約30%以上的人類基因蛋白。且每個miRNA可產生多個靶點效應，每個靶點又會接受多個miRNAs調控。腫瘤的進展過程中，由于表觀遺傳學及大量遺傳學的變化，使得蛋白和基因表達異常，細胞凋亡、細胞黏附、細胞周期、DNA修復等亦受到影響[7]。故研究miRNA與腫瘤早期診斷、分期變化、侵襲、遷移、預后和復發等機制密切相關[8]，其既可作為抑癌基因促進抑癌因子釋放，也可作為致癌基因誘導腫瘤發生，其功能均取決于所調控之靶基因[9]。pri-miR-433含1 809個核苷酸、124個堿基對。同于12號染色體的miR-127基因與其有297個堿基對發生重疊。故存在miRNA之間的基因結構相互重疊，從而可擴大miRNA基因本身所攜帶的可應用信息量，進一步適應于較多種類的復雜的生理相關功能的調節[10-11]。本研究著重探討miR-433對結直腸癌細胞生物學功能的影響。首先，檢測miR-433在臨床組織標本中的表達水平，與非腫瘤組織相比，癌組織中miR-433的表達水平明顯降低，同時在血清中也得到了類似的結果。此外，本研究也證實，在TNMⅠ～Ⅳ 分期中，miR-433的表達水平也逐漸降低。這表明miR-433水平與結直腸癌疾病進展呈一定的負相關。

為了證實miR-433與結直腸癌生物學中的作用，隨后檢測了結直腸癌細胞系HT-29、HCT-116、SW480和正常的NCM460細胞系中miR-433的表達水平，結果示：HT-29、HCT-116和SW480中miR-433表達水平顯著低于正常結直腸細胞系NCM460。隨后以SW480為研究對象，通過轉染miR-433 mimic，檢測細胞的增殖水平、細胞周期以及侵襲與遷移的變化。CCK-8結果顯示，轉染miR-433 mimic以上調其表達水平后，與對照組相比，細胞的增殖活性明顯降低。流式細胞術結果也顯示，過表達miR-433 minic后，G2和M期細胞明顯增多，說明miR-433參與細胞周期阻滯，與其他研究結果類似[12]。惡性腫瘤最顯著的特征是侵襲與遷移。隨后通過劃痕實驗和Transwell小室法也證實，上調miR-433表達后，細胞的侵襲與遷移水平顯著降低，表明miR-433能負向調控SW480細胞的增殖與轉移。

總之，本研究證實miR-433高表達可以抑制結腸癌細胞的遷移、增殖，與腫瘤的發生呈負相關。miR-433的異常調節可能是結直腸癌診斷和預后的一個潛在生物標志物。結合生物標志物組合的敏感性和特異性，通過調節血漿、組織中miR-433的方法可能發展成為結直腸癌防治的重要靶點。