負載血管生成素1的聚乳酸羥基乙酸-聚乙二醇納米微粒促進大鼠心肌梗死后心肌修復

方 濤，楊婉浠，李 昕，叢志成，張沛宗，祁 泉，宋 兵*

(蘭州大學 1.第一臨床醫學院；2.第一醫院 心血管外科，甘肅 蘭州 730000)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是造成人類死亡的常見原因之一，每年大約導致730 萬人死亡[1]。在過去的幾十年間，盡管對其的診療取得了長足進展，但仍造成54%的患者在發病5 年內死亡[2]。治療性血管新生是通過將外源性血管生長因子植入到缺血組織中以達到缺血組織重新獲得血液供應的目的。血管生成素1(angiopoietin1，Ang1)不但可以促進活性血管的生成，也能抑制內皮細胞的凋亡。但其應用仍受到多種因素的制約：1)Ang1難于提取、制備、應用；2)Ang1半衰期短，難于維持足夠的局部血藥濃度；3)持續注射，會產生較大副作用[3]。

PLGA-PEG能夠有效增加小分子蛋白的穩定性，提高其生物利用度，是一種較好的藥物載體，特別適用于蛋白質等藥物的注射治療[4]?；诖?，本研究通過將PLGA-PEG和Ang1偶聯，進行心肌梗死周圍局部注射,改善心肌梗死大鼠心臟功能，為其以后的臨床應用提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

重組人血管生成素1和血管生成素1酶聯免疫吸附試劑盒(ELISA)均(R&D Systems公司)；PLGA(濟南岱罡生物工程有限公司)；PEG(JenKem科技公司)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(甘肅華譜生物科技有限公司)；CD31一抗(上海允麥生物科技有限公司)；α-SMA(上海信帆生物科研所)；Fluor? 594 熒光二抗和Fluor? 488 熒光二抗(Abcam公司)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(北京盛科博源生物科技有限公司)。年齡6～8周SPF級雄性SD大鼠(體質量200～250 g)中科院蘭州獸研所實驗動物，許可證號：SCSK(甘2015-0001)。本研究中所有程序均符合“實驗動物護理和使用指南”(國家衛生研究院，第85-23號出版物，修訂版)，并在蘭州大學動物使用委員會監督下進行。

1.2 方法

1.2.1 納米微粒的制作及物理表征：用雙乳液法制備了Ang1的PLGA-PEG納米微粒[5]。并使用Philips CM120透射電子顯微鏡檢測粒徑和形態，通過Elisa法檢測其包封率(包封率%=納米微粒中Ang1的測得量/制備載藥納米粒時Ang1的加入量×100%)以及體外釋放過程。

1.2.2 大鼠的分組及處理：復制大鼠心肌梗死模型[6]。1 周后彩超檢測心臟，將大鼠隨機分組：模型組(心肌梗死周圍區域注射100 μL PBS溶液)(n=8)、Ang-1組[注射含Ang1的PBS溶液(100 μL，25 ng/μL)](n=8)、Ang1-PLGA-PEG組[注射100 μL納米微?；鞈乙?，約含(1.61±0.05)μg Ang1](n=9)，注射深度約3 mm。于4 周后收集超聲心動圖數據，并分析。然后，處死大鼠并收取心臟組織。用4%甲醛灌注心臟20 min，用PBS漂洗約10 min。然后將心臟樣品進行固定、包埋并切片。

1.2.3 Masson染色檢測組織增生：在鏡下觀察纖維結締組織增生情況，并且使用Image J軟件測量以下數據：心室壁厚度(mm)、隔膜厚度(mm)、瘢痕厚度(mm)、左室腔面積(mm2)和整個左室面積(mm2)。每個參數測量進行3 次。然后，計算每個參數的平均值。纖維結締組織可根據增生情況分為4 級[7]。相對瘢痕厚度：瘢痕壁的平均厚度值與未受影響的心室壁的平均厚度值的比例。梗死擴張指數:(左室腔面積/整個左室面積)/相對瘢痕厚度[8]。

1.2.4 免疫熒光染色檢測血管新生：先使用CD31和α-SMA抗體進行血管染色，然后在滴加相應的Fluor? 594 熒光二抗和Fluor? 488 熒光二抗。在熒光顯微鏡下通過α-SMA和CD31陽性來識別梗死周邊區域的小動脈和毛細血管形成情況并拍照，隨機選擇8個圖像，并計算1 mm2內小動脈和毛細血管數量的平均值。以α-SMA陽性的血管數量相對于血管的總數量來計算成熟指數[9]。使用Image J軟件進行所有測量。

1.2.5 TUNEL染色檢測細胞凋亡：使用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測心肌細胞凋亡。在熒光顯微鏡下隨機選擇5個視野中凋亡細胞核和總細胞核，使用Image J軟件計算TUNEL陽性細胞核和總細胞核數目。TUNEL陽性細胞核的百分比定義為凋亡細胞核數與細胞核總數的比值[10]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 納米微粒檢測

經檢測，確定制備的納米微粒的平均大小為180 nm，Ang1在微粒中的包封率為64.3%±2.4%[即為每毫克納米顆粒包含(321.5±1.1)ng的Ang1]。Ang1-PLGA-PEG納米微粒在前3 d釋放了46.3%的Ang1，前10 d釋放了73.9%，在隨后的時間，Ang1的釋放速率減慢直到第30天(圖1)。

圖1 Ang1-PLGA-PEG 納米微粒中Ang1的體外釋放曲線Fig 1 In vitro released profiles of angiopoietin 1

2.2 彩超檢查心臟

注射后4 周：與模型組和Ang1組相比，Ang1-PLGA-PEG組左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)明顯增大，且左室縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)也增加；而左室收縮末期內徑(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs)減小，同樣左室舒張末期內徑(left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd)也有類似的趨勢(圖2)。

A.representative echocardiographic images from each group；B.the left ventricular ejection fraction(LVEF)；C.left ventricular fractional shortening(LVFS)；D.left ventricular internal diameter at end-systole(LVIDs);E.left ventricular internal diameter at end-diastole(LVIDd)was assessed via two-dimensional echocardiography;*P<0.05 compared with the model control group;#P<0.05 compared with Ang1 group；Ang1-PLGA-PEG.angiopoietin1 loaded in PLGA-PEG NPs圖2 超聲心動圖評估Fig 2 Echocardiographic

2.3 Masson染色檢測瘢痕組織增生

與模型組和Ang1組相比，Ang1-PLGA-PEG組相對瘢痕厚度顯著增加，梗死擴張指數明顯減小(圖3)；且纖維結締組織增生情況較低(表1)?？梢娔Ｐ徒M和Ang1組梗死部位形成大量的纖維結締組織,可見較少的心肌肌纖維組織，梗死部位的周邊纖維結締組織與心肌組織之間緊密相間分布,梗死壁厚度較小。Ang1-PLGA-PEG組梗死部位形成少量的纖維結締組織,可見較多的心肌肌纖維組織，梗死部位的周邊心肌組織和纖維結締組織稀疏相間，梗死壁厚度較大。

A.representative Masson’s trichrome staining,scale bars=2 mm；B.quantification of the relative scar thickness;C.infarct expansion index based on Masson’s trichrome staining；*P<0.05 compared with the model control group;#P<0.05 compared with Ang1 group；Ang1-PLGA-PEG.angiopoietin1 loaded in PLGA-PEG NPs圖3 Masson染色檢測瘢痕組織增生Fig 3 Scar tissue hyperplasia was detected by Morphological

表1 梗死中心部位纖維結締組織增生情況table 1 Proliferation of fibrosis in central area of myocardial infarction (×40，n=8)

2.4 免疫熒光染色檢測細胞凋亡和血管形成

與模型組和Ang1組相比，Ang1-PLGA-PEG組血管形成較多且血管成熟指數更高(圖4)；而凋亡細胞數量顯著減少(圖5)。

A.representative immunohistochemical staining of blood vessel in the peri-infarct myocardial tissue;CD31(red)and α-SMA (green)staining for the blood vessels;scale bars=50 μm;B.quantification of the capillary density;C.maturation index;*P<0.05 compared with the model control group;#P<0.05 compared with Ang1 group；Ang1-PLGA-PEG.angiopoietin1 loaded in PLGA-PEG NPs圖4 血管形成的免疫熒光染色Fig 4 Immunofluorescence assessment of the

A.representative photomicrographs of TUNEL staining (green)and DAPI(blue)staining for the PEG-PLGA-Ang1 nanoparticles group，angiopoietin1 group，normal model control group in peri-infarct region,scale bars=50 μm；B.quantification of the percentage of TUNEL-positive nuclei;*P<0.05 compared with the model control group；#P<0.05 compared with Ang1 group；Ang1-PLGA-PEG.angiopoietin1 loaded in PLGA-PEG NPs圖5 TUNEL檢測心肌細胞凋亡Fig 5 Cardiomyocyte apoptosis was detected by

3 討論

目前，心肌梗死的主要治療方式有:溶栓、冠狀動脈搭橋、支架植入等。盡管患者病死率已顯著下降,生存率不斷提高，但仍有部分患者經治療后亦發生心力衰竭。局部注射促血管生成活性蛋白或干細胞改善梗死部位血液供應為一種新興的治療策略[11-12]。眾所周知，Ang1是一種重要的促血管生成活性蛋白，在血管生成過程中具有重要作用。將Ang1搭載到PLGA-PEG納米微粒中，使其緩慢、持續釋放具有生物學活性的Ang1，以克服其半衰期短的局限性。

雖然Ang1組和Ang1-PLGA-PEG組在治療后4周均增加了新生血管密度，但后者的程度明顯更高，這種作用可能歸因于Ang1與PLGA-PEG納米微粒結合后，在同等劑量下能夠長久、持續的作用于組織細胞。相對于Ang1組來說，Ang1-PLGA-PEG組不僅促進新生血管，而且誘導血管的成熟Ang1-PLGA-PEG組血管成熟指數高于Ang1以及單純模型組。

TUNEL染色結果表明:Ang1-PLGA-PEG組僅有少量細胞凋亡，已經有效抑制心肌細胞凋亡。但Ang1組與模型組具有相似程度的大量細胞凋亡，可能Ang1組藥物抑制細胞凋亡僅維持數分鐘或數小時，這仍需要進一步驗證。另外，誘導血管新生能夠挽救受損的缺血組織并啟動自我修復途徑[13]。Ang1-PLGA-PEG納米微粒誘導梗死心肌周圍組織中血管密度及血管成熟度增加將減輕周圍區域的局部缺血，通過向梗死區域輸送更多的營養及氧氣，這也增大其抑制細胞凋亡的效能。

心肌細胞凋亡后，纖維結締組織增生以替代原有的心肌組織，導致心室病理性重塑的發生。Masson染色結果顯示相對于其他兩組，Ang1-PLGA-PEG納米微粒可以有效減弱心室病理重塑。而且，病理性重塑會導致心肌組織中小動脈的減少，會加重組織缺血導致更多的心肌細胞凋亡這一惡性循環的發生。

心肌修復的目的在于恢復心臟功能，心臟彩超結果表明Ang1組與Ang1-PLGA-PEG組盡管在治療4 周后都顯示出LVEF增大、LVIDs及LVIDd減小，但以Ang1-PLGA-PEG組左室功能改善更加明顯，更加有效防止左室功能惡化。

綜上所述，Ang1-PLGA-PEG納米微粒用于心肌梗死后局部心肌內注射，可以誘導血管形成、抑制心肌細胞凋亡及減輕心臟不良重塑從而改善心肌梗死后的心臟功能，對受損心臟起到一定程度的治療和保護作用,為其臨床應用增加了實驗依據。