普伐他汀激活子癇前期小鼠MAPK抗凋亡信號通路

王芙蓉，嚴 謹，賀豐杰*

(1.陜西中醫藥大學附屬醫院 產科,陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫藥大學 第一臨床醫學院，陜西 咸陽 712046)

子癇前期(pre-eclampsia,PE)是孕產婦和新生兒發病和死亡的主要原因。其確切病因尚不清楚，但一般認為與血管生成失衡、炎性反應、氧化應激和內皮功能障礙有關[1]。PE與成人心血管疾病(adult cardiovascular disease,CVD)具有多種相同的病理生理途徑，如炎性反應、內皮功能障礙以及糖尿病、高血壓等[2]。可溶性fms樣酪氨酸激酶1(soluble fms-like tyrosine kinase-1,sFlt-1)在小鼠中過度表達會導致高血壓，血管反應性異常以及PE表型其他特征的發生[3-5]，可用于誘導小鼠PE模型。他汀類藥物具有降脂、抗氧化、抗感染等多種作用，在臨床中應用廣泛。由于CVD和PE之間的相似性、他汀類藥物在PE預防中的生物可行性以及動物實驗數據，使用他汀類藥物預防PE漸漸成為一些研究人員關注的焦點[6]。在進行哺乳的PE母鼠中使用普伐他汀則可以恢復其血管生成平衡和血管輪廓，抑制高血壓、腎臟損傷以及與PE有關的生長受限[5-7]。此外，細胞滋養細胞的異常侵襲和過度凋亡與PE的發展有關[7]。本研究的目的在于探究普伐他汀對PE小鼠胎盤組織中抗凋亡路徑的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑、動物及細胞

編碼sFlt-1的復制缺陷型重組腺病毒(北京本元正陽公司進行制備并進行滴度測定)；ICR小鼠[西安交通大學(SCXK(陜)2014-003)]；sFlt-1 ELISA檢測試劑盒(R&D Systems公司)；293細胞(ATCC)；p-ATF-2、p-p38、p-ERK、p-HSP27、p-STAT3、p-p53及β-actin抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒載體的擴增及純化：采用HEK293細胞進行培養和轉染。待轉染的細胞于正常條件下培養2～3 d，至70%～80%匯合時可以進行轉染。將含有1%青霉素/鏈霉素、2%胎牛血清以及病毒的轉染培養基加入到每個平板中，培養20 h后收集細胞，離心去掉上清液，得到的細胞儲存在-80 ℃中或直接用于純化。水浴融化凍存的細胞，然后將2 mL Tris緩沖液(10 mmol/L，pH 8.0)加入其中，反復凍融6次。1 000 r/min離心10 min，得到包含病毒的上清液。將包含病毒的上清液加入CsCl中直到1.43 g/mL，離心后用18號針頭和5 mL注射器收集腺病毒條帶，再注入到CsCl 為1.34 g/mL的離心管中，4 ℃、35 000 r/min離心16 h。收集富集有腺病毒顆粒的條帶，裝入平衡好的截留分子質量為3.5 ku的透析袋中進行透析，經溶液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,0.1% SDS)稀釋后用分光光度計測算其濃度。

1.2.2 動物的分組及處理：將正常妊娠第9天的ICR小鼠隨機分為：對照組(Con)，不經任何干預；PE模型組(PE)，尾靜脈注射攜帶sFlt-1的病毒以誘導小鼠子癇前期(109PFUs/100 μL)；治療組(PE+Pravastatin)，按體質量喂灌普伐他汀[Pravastatin,5 mg/(kg·d)]，直至母鼠停止哺乳。第19天收集母鼠心臟血、胎盤，-80 ℃保存備用。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測：室溫凝固收集的血樣，于4 ℃放置過夜，3 000×g離心10 min，取上清。按照ELISA試劑盒說明檢測各組小鼠血清sFlt-1，450 nm波長下測量吸光度值(A)并計算sFlt-1水平。

1.2.4 免疫印跡分析(Western blot)檢測：在冰冷環境下粉碎凍干的胎盤，然后在裂解緩沖液中勻漿；4 ℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清液；采用Bradford法(Bio-Rad)測定蛋白質濃度后進行SDS-PAGE，分離蛋白質。將分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，然后用3% (w/v)的脫脂奶粉在含0.1%吐溫20的PBS (10 mmol/L Tris,140 mmol/L NaCl,0.1% Tween 20,pH=7.4)中室溫封閉1 h。之后加入一抗，4 ℃孵育過夜；再用二抗室溫孵育1 h。檢測激活轉錄因子-2(activating transcription factor-2,ATF-2)、細胞外調節蛋白激酶(extra-cellular regulated protein kinases,ERK)1/2、熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)27、p38 MAPK、信號傳導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)3和p53。以β-actin作為內參，用化學發光(ECL)檢測系統進行分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 母鼠基本情況

妊娠18 d后，對照組、PE模型組以及治療組的母鼠體質量、產仔數及胎盤質量差異無統計學意義(表1)。

表1 母鼠基本情況Table 1 Basic information of

2.2 血清sFlt-1水平

PE模型組小鼠血清sFlt-1水平顯著高于對照組(P<0.05)；而經普伐他汀治療后，顯著下調(P<0.05)(圖1)。

2.3 胎盤組織ATF-2、p38、ERK蛋白磷酸化水平

PE模型組小鼠胎盤組織ATF-2、p38以及ERK蛋白的磷酸化水平均顯著低于對照組(P<0.05)。而經普伐他汀治療后，顯著上調(P<0.05)(圖2，表2)。

表2 小鼠胎盤組織p-ATF-2,p-p38和p-ERK相對表達量Table 2 Relative expression of p-ATF-2,p-p38 and p-ERK in placenta of different mice groups

圖2 小鼠胎盤組織ATF-2、p38、ERK蛋白磷酸化水平Fig 2 phosphorylation of ATF-2,p38 and ERK proteins in placenta of different mice groups

2.4 胎盤組織HSP27、STAT3蛋白磷酸化水平

PE模型組小鼠胎盤組織HSP27和STAT3蛋白的磷酸化水平顯著低于對照組(P<0.05)。而經普伐他汀治療后，顯著上調(P<0.05)(圖3，表3)。

表3 小鼠胎盤組織p-HSP27和p-STAT3的相對表達量Table 3 Relative expression of p-HSP27 and p-STAT3 in placenta of different mice

圖3 小鼠胎盤組織HSP27、STAT3蛋白磷酸化水平Fig 3 Phosphorylation of HSP27 and STAT3 proteins in placenta of mice

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with PE圖1 各組小鼠血清sFlt-1濃度Fig 1 serum concentration of sFlt-1 of different

2.5 胎盤組織p53蛋白磷酸化水平

對照組、PE模型組和治療組小鼠胎盤組織p-p53蛋白的磷酸化水平無差異(圖4)。

圖4 各組小鼠胎盤組織p53蛋白磷酸化水平Fig 4 phosphorylation of p53 in placenta of different

3 討論

PE是最常見的高血壓并發癥，同時也是導致孕產婦和胎兒并發癥和死亡的主要原因之一。sFlt-1升高是導致母體出現PE癥狀的最主要原因之一。血清sflt-1水平越高，利用的VEGF水平越低，內皮功能障礙越嚴重[8]。子癇前期孕婦血漿sFlt-1濃度高于正常孕婦，嚴重子癇前期孕婦高于輕度子癇前期孕婦[9]。過度表達sFlt-1蛋白的大鼠具有高BP，蛋白尿和內皮損傷，表現出明顯的PE癥狀[5]。基于此，本研究通過轉染攜帶sFlt-1片段的腺病毒成功構建了PE小鼠模型。

p38MAPK信號通路是調節細胞凋亡的重要網絡，同時能夠促進細胞存活。然而，關于該通路在PE發病機制中的作用尚未明確。普伐他汀因親水性強、抑制HMG-Co A活性的能力最低，難以通過胎盤屏障，易于清除等特點成為最受關注的他汀類藥物。普伐他汀通過激活內皮細胞中的ERK1/2、Akt和MAPK途徑誘導血管生成，調節sFlt-1和sEng水平來調節血管生成平衡[10-11]。ERK/MAPK信號通路對胎盤的正常生長、發育和形態發生至關重要。當ERK1信號傳導受到抑制時，滋養層細胞的氧化損傷加重，暗示了ERK1/2通路在細胞抵抗氧化損傷促進存活中的作用[12]。

在本研究中，sFlt-1過表達導致小鼠表現出PE表型，各胎盤組織中的抗凋亡因子(ATF-2、p38、ERK、HSP27和STAT3)磷酸化水平均顯著降低。ATF-2、p38和ERK是典型的促生長/抗凋亡因子，在促進細胞增殖中起到關鍵作用。HSP27和STAT3蛋白已被證明與胚胎發育過程中的氧化應激和細胞凋亡有關，是重要的促生存標志物和轉錄因子[13-14]。這些因子磷酸化水平的降低，提示了sFlt-1引發 PE可能與抑制MAPK信號通路的激活，進而抑制內皮細胞生存，促進細胞過度凋亡有關。經過普伐他汀治療后，ATF-2、p38、ERK、HSP27和STAT3的磷酸化水平均得到顯著上調，提示普伐他汀可能通過促進MAPK信號通路的激活，進而促進內皮細胞生存，抑制凋亡來發揮對胎盤的保護作用。此外，p53蛋白是細胞增殖周期的負調節因子，能夠促進細胞凋亡。在本研究中未觀察到p53磷酸化水平的變化，提示p53可能并未直接參與MAPK信號促生存的過程。

本研究的結果顯示普伐他汀能夠上調PE小鼠MAPK信號通路中抗凋亡因子的磷酸化水平，提示了普伐他汀對PE的治療作用與激活MAPK通路的抗凋亡路徑有關。