HPLC法測定苡仁清痹濃縮丸中鹽酸小檗堿的含量

蔡建峰,楊真真,鄒福賢,周曉蘭

(泉州市正骨醫院藥學部, 福建 泉州 362000)

苡仁清痹丸來源于泉州市正骨醫院的臨床驗方,主要由黃柏、蒼術、川牛膝、薏苡仁、黃芩、炒白術、木瓜、當歸、雞血藤、車前子、茯苓、紅花、澤瀉、陳皮和木豆葉等中藥組成,該方以四妙丸為核心,輔以黃芩、車前子等清熱利濕；茯苓、陳皮和澤瀉利水；紅花、當歸、白芍和赤芍等通經止痛；雞血藤和木瓜舒經活絡,全方具有清熱利濕、通絡止痛的作用,在臨床上療效確切,常用于濕熱蘊結型相關疾病,如股骨頭壞死、骨性關節炎、脊柱關節病、痛風性關節炎等的治療[1],以往研究通過中醫辨證論治將股骨頭缺血性壞死分為濕熱內阻型、氣滯血瘀型和肝腎虧虛型三種,并對其中100多例濕熱內阻型患者并采用苡仁清痹丸進行治療股骨頭缺血性壞死,總有效率達94.58%,效果顯著[2]。本方長期運用于臨床,安全性好,療效較佳,作用機制清楚,具有較高的開發價值,其中“蒼術-黃柏-薏苡仁”為治療風濕病的核心藥組[3],也為本方的重要組成部分,現代藥理研究表明其能夠通過多種有效成分、多個靶點以及一氧化氮生物合成和炎癥反應等多條通路的協同機制進行治療痛風和類風濕關節炎等疾病[4-5]。

泉州市正骨醫院是一家擁有推拿科、骨科、軟傷科、康復科和制劑室等30多個科室的三級甲等骨傷專科醫院,其制劑室始創于1962年,為集醫療、教學、科研一體的藥學科室,目前生產的劑型主要有丸、散、膏、搽和酒劑等傳統劑型,設備設施完善,是泉州市唯一一家具有中醫特色中藥制劑室,并擁有《制劑許可證》的醫療機構。苡仁清痹丸(濃縮丸)目前已完成制劑工藝研發[1],但缺乏相應的質量控制標準,不利于穩定生產和保障產品質量。高效液相色譜儀是《中國藥典》中最常用的檢測儀器之一,在質量控制方面運用非常廣泛,如HPLC用于疏風愈痛丸和理氣舒心片等中成藥的質量控制[6-7]。根據2020版《中國藥典》,在苡仁清痹丸(濃縮丸)的藥物組成中含有HPLC含量測定項的共有13味,指標性成分含量限定較高(超過1%)的有黃芩、陳皮、紅花、黃柏、赤芍和白芍等[8],其中黃柏為組方中的核心藥物,對于組方發揮療效具有重要作用。現代藥理研究表明小檗堿能緩解痛風性關節炎癥狀,抑制炎癥反應,其機制可能與炎癥因子和NLRP3/TLRs信號通路有關[9-10]。而四妙丸在2020版《中國藥典》中,檢測指標同樣為鹽酸小檗堿,因此本實驗確定檢測對象為鹽酸小檗堿,其成分含量較高,易于檢出,也為組方中有效成分之一,具有代表性。

因此本文擬通過高效液相色譜對苡仁清痹丸(濃縮丸)中的小檗堿成分進行含量測定,為苡仁清痹丸(濃縮丸)的質量控制提供實驗基礎,將有利于保障大批量生產時的質量穩定,提高臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100(Agilent有限公司)；PX225DZH電子天平(Ohuas有限公司)；Millipore超純水儀(Millipore有限公司)。

1.2 試藥

苡仁清痹丸(濃縮丸)(泉州市正骨醫院藥學部實驗室制備,批號：20210601,20210602,20210603)；鹽酸小檗堿(中檢院,批號110713-201814)；乙腈和甲醇均為色譜純,購自國藥集團試劑有限公司；磷酸購自阿拉丁股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 方法2.1 色譜條件

采用Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流動相乙腈-0.1%磷酸水(1∶3)；檢測波長345 nm；進樣量20μL；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；等度洗脫25 min。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取對照品5.0 mg置于25 mL容量瓶中,加甲醇超聲溶解后定容,制得濃度為200μg/mL的對照品溶液。分別精密量吸取對照品溶液0.5、1、2、5、10 mL,置于10 mL容量瓶中,甲醇定容,搖勻,得濃度為10、20、40、100、200μg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品1.0 g粉末(過三號篩),置具塞錐形瓶中,加入70%甲醇50 mL,超聲60min,放冷,用70%甲醇補足減失重,搖勻,0.45μm濾膜濾過,即得供試品溶液。

2.4 陰性供試品制備

按處方比例稱取除黃柏外的其他藥物后按苡仁清痹丸(濃縮丸)制法制成陰性制劑,再按照2.3項下方法制備陰性供試品溶液。

2.5 專屬性試驗

精密吸取上述各溶液20μL,按2.1項下色譜條件進樣。結果表明,苡仁清痹丸(濃縮丸)供試品溶液與對照品溶液在相同保留時間處均有較大吸收,與相鄰成分達到基線分離,陰性溶液中無干擾。結果見圖1。

圖1 HPLC色譜圖A:對照品HPLC，圖譜B:供試品HPLC圖譜，C:陰性溶液HPLC圖譜；1:鹽酸小檗堿

2.6 線性關系考察

將2.2項下不同濃度對照品,按照2.1項下的色譜條件測定,以濃度(X)-峰面積(Y),繪制標準曲線,得回歸方程為：Y=22.258X-9.6167(r=0.9999),表明在10～200g/mL范圍內線性關系良好。

2.7 精密度試驗

取濃度為40μg/mL的對照品溶液20μL,按照2.1項下色譜條件平行進樣6次,測定峰面積,結果RSD為0.94%(n=6),表明精密度良好。

2.8 重復性試驗

取同一批次苡仁清痹丸(濃縮丸),按照2.3項下方法,制備6份供試品溶液,按照2.1項下色譜條件測定,根據2.6項下回歸方程計算含量及其RSD,結果RSD為1.19%(n=6),表明該方法重復性良好。

2.9 穩定性試驗

取同一份2.3項下供試品溶液分別于0、1、2、4、6、8、12、24h按照2.1項下色譜條件進樣,測定相應峰面積,計算含量,結果鹽酸小檗堿RSD為0.45%,表明樣品穩定性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取同一批樣品6份,每份0.5 g,分別精密加入1.1 mg對照品,按2.3項制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件進樣分析,計算回收率,結果平均加樣回收率為98.16%,RSD為1.73%(n=6),表明本法具有良好的回收率。結果見表1。

表1 加樣回收率測定結果(n=6)

2.11 結果

取3批苡仁清痹丸(濃縮丸)樣品制備為供試品溶液,按2.1項下色譜條件進行含量測定,根據2.6項下回歸方程計算含量,結果3批苡仁清痹丸(濃縮丸)中鹽酸小檗堿分別為2.20 mg/g(批號：20210601)、2.10 mg/g(批號：20210602)、2.21 mg/g(批號：20210603)。因此暫定苡仁清痹丸(濃縮丸)每1 g含黃柏以鹽酸小檗堿計,不得少于2.0 mg。

3 討論

3.1 色譜條件優化

通過對鹽酸小檗堿標準品溶液進行紫外掃描,可見345 nm、263 nm和227 nm處均有波峰,吸收均較大,但是結合樣品,發現在345 nm處干擾最小。有機相通過比較乙腈和甲醇,發現乙腈作為有機相,洗脫能力更強,使得圖譜噪音更低,峰型更為對稱[11]。關于水相,考察酸性對其的影響,發現加入酸水后,鹽酸小檗堿峰型更為尖銳,減少脫位情況,而其中又以0.1%磷酸水效果最好。考察了30、35、40℃不同柱溫時對樣品峰形、保留時間、分離度的影響,發現溫度對于目標峰的影響較小,均能較好的得到測定結果,出于節約能源考慮,最終選擇30℃作為柱溫。不同品牌的色譜柱具有細微的差別,通過比較Diamonsil C18和Ultimate XB-C18色譜柱,發現兩者在色譜峰型上具體較小的差別,相比較來說Diamonsil C18所得到的峰型更好,更適合本實驗樣品,有利于計算出樣品的真實含量。因此本試驗選擇了乙腈-0.1%磷酸水作為流動相,采用Diamonsil C18色譜柱,柱溫30℃,檢測波長345 nm為本次實驗色譜條件。

3.2 提取方法考察

本文對提取提取溶劑進行考察,發現甲醇的提取效果優于乙醇,提取更完全；考察比較了30%、50%、70%和90%溶劑濃度,發現70%甲醇提取率最高。對超聲和回流兩種提取方法比較,發現超聲提取方便快速。此外對不同的超聲時間進行比較,發現含量隨著超聲時間逐漸升高,在60 min之后含量基本趨于一致,說明在60min時提取完全。對料液比同樣進行考察,分別以1∶10、1∶30、1∶50、1∶70的比例進行提取,結果表明隨著料液比的增加,提取逐漸充分,并在1∶50達到平臺期。因此選擇料液比1∶50進行提取。綜合各種因素,最終選擇采用50倍量的70%甲醇超聲60 min進行鹽酸小檗堿提取。

綜上所述,本試驗建立了一種采用高效液相色譜法測定苡仁清痹丸(濃縮丸)中的鹽酸小檗堿的含量的方法；采用50倍量的70%甲醇超聲60 min進行提取,以乙腈-0.1%磷酸水作為流動相,Diamonsil C18色譜柱,柱溫30℃,檢測波長345 nm為色譜條件,其方法學驗證均符合相關標準,可用于苡仁清痹丸(濃縮丸)半成品和成品中鹽酸小檗堿的含量測定。該方法簡便、準確、快速,為準確地評價苡仁清痹丸(濃縮丸)的質量提供實驗依據,有利于苡仁清痹丸(濃縮丸)的穩定生產,減少質量參差不齊的情況,從而更好的為臨床服務,保障臨床療效。