生物飼料伴侶在凡納濱對蝦中的應用研究

劉寶同，梁晶晶，李培根，王永慶，秦 朋，梁 奕

（青島根源生物技術集團有限公司，山東青島 266111）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對蝦，是中國重要的經濟養殖水產動物之一，憑借生長速度快、營養要求低、出肉率高、抗逆性強等優點，成為我國養殖面積最廣、養殖產量最高的對蝦種類[1]。據統計，2019 年我國水產品總產量為5 079 萬t，其中凡納濱對蝦產量高達181.5 萬t[2]。然而，隨著養殖規模的不斷擴大和集約化程度的不斷提高，水質污染、疾病爆發、養殖成活率低等一系列問題日漸突出。在影響凡納濱對蝦養殖成功率的諸多因素中，飼料是不可忽視的重要因素，而所投喂的飼料中又有部分飼料蛋白通過糞便以氨氮形式排出體外，既污染水質又造成浪費。微生態制劑和酶制劑在有效劑量下持續使用會改善腸道及生長環境，降低不良環境下動物的應激和疾病發生率[3-5]。但實際飼料生產過程中，為了保證水中穩定性和飼料原料熟化程度，一般會高溫（≥90℃）熟化30 min 以上，造成益生菌、酶制劑有效成分損失[6-7]。目前市場上菌酶制劑大多都是在養殖現場以拌料的形式直接投喂，不僅工作量大，而且容易出現拌料不均勻等現象，同時黏附到飼料表面的菌酶入水后易散失到水體中，利用效率低下。本研究將魚粉、豆粕等基礎日糧原料與以丁酸梭菌、枯草芽孢桿菌、蛋白酶、木聚糖酶為主的菌酶制劑按比例通過冷制粒工藝單獨制粒（本研究稱其為生物飼料伴侶），然后與飼料混合均勻投喂，探究其對凡納濱對蝦生長性能、非特異性免疫能力和腸道菌群的影響，為其在生產實踐中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本研究中制備生物飼料伴侶所需原料由青島根源生物技術集團有限公司提供，基礎日糧為常規飼料工藝制備。生物飼料伴侶及基礎日糧原料組成及營養成分見表1。

表1 生物飼料伴侶及基礎日糧原料組成及營養成分（風干基礎）

1.2 試驗設計 凡納濱對蝦購于山東省萊陽市羊郡，規格為3～5 cm。試驗開始前經7 d 馴化，從中選取192尾規格一致、體質健康、初始重為（0.48±0.04）g 的凡納濱對蝦，隨機分為4 組，每組4 缸，每缸12 尾，對照組飼喂基礎日糧，試驗組分別以生物飼料伴侶按5%、10%、20%比例替代基礎日糧進行飼喂，試驗期30 d。試驗期間維持水溫26～28 ℃，pH 8.0～8.4，亞硝酸鹽≤0.05 mg/L，弧菌含量＜2 000 CFU/mL。采用電磁式空氣泵連續充氣，中科直流變頻循環水泵流量為12 000 L/h，全系統循環8 次/d，每3 d 換水0.1 m3。

1.3 飼養管理 試驗在根源生物集團技術支持中心水生態實驗室進行，每日8:30、12:30 和16:30 各投喂1 次。按體重比例調整投喂量，保證吃料時間在60～90 min，每天核對對蝦數量，觀察攝食情況并記錄。

1.4 樣品采集與指標檢測

1.4.1 生長性能 分別在試驗開始前和結束后將凡納濱對蝦禁食16 h，逐缸核對數量后撈出，用濾紙輕輕吸干蝦體表面水分后進行稱重，計算增重率、飼料系數、特定生長率及成活率。計算公式如下：

增重率（%）=100×[（Wt-W0）/W0]

特定生長率（%/d）=100×[（lnWt-lnW0）/t]

飼料系數=F/（Wt-W0）

成活率（%）=T活/T總×100其中，W0為初始平均體重（g），Wt為終末平均體重（g），t 為試驗天數（d），F 為采食量（g），T活為成活尾數，T總為總尾數。

1.4.2 血清非特異性免疫酶活性的測定 用l mL 無菌注射器從對蝦頭胸甲后插入心臟抽取血液，裝至2 mL 無菌EP 管中，于4℃冰箱靜置過夜。血清中堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）和超氧化物歧化酶（SOD）活性均采用試劑盒進行分析測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，按照說明書提示方法進行測定。

1.4.3 凡納濱對蝦腸道樣品采集 在放有冰袋的解剖盤上用無菌解剖剪解剖取出對蝦腸道全腸，分裝至2 mL無菌EP 管中并標記編號，迅速放入液氮中速凍，之后放于-20℃保存，送至青島百邁克生物技術有限公司進行微生物多樣性分析。采用Illumina 高通量測序樣本原始數據，用Trimmomatic 軟件進行序列質控，使用Flash 軟件進行序列拼接、優化及統計。

1.5 統計分析 試驗數據以平均值±標準差表示，使用Excel 處理數據，并用SPSS 25.0 軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）及Duncan's 多重比較檢驗，以P＜0.05 作為差異顯著判斷水平。

2 結果

2.1 生物飼料伴侶對凡納濱對蝦生長性能的影響 由表2 可知，5%、10%和20%替代組在不影響凡納濱對蝦存活率的同時可以提高其增重率、特定生長率并降低餌料系數，與對照組相比，10% 替代組增重率提高19.6%、特定生長率提高7.9%（P＜0.05）。

表2 生物飼料伴侶對凡納濱對蝦生長性能的影響

2.2 生物飼料伴侶對凡納濱對蝦血清非特異性免疫酶活性的影響 由表3 可知，5%、10%和20%替代組均可顯著提高凡納濱對蝦血清中ACP 和AKP 的活力，且隨替代量增加，各試驗組酶活力呈升高趨勢（P＞0.05）。5%替代組可提高凡納濱對蝦血清中SOD 活力（P＞0.05），當替代量為10% 和20% 時，其SOD 活力顯著高于對照組。

表3 生物飼料伴侶對凡納濱對蝦非特異性免疫的影響

2.3 腸道菌群結構分析

2.3.1 凡納濱對蝦腸道菌群結構的α多樣性分析 Chao1指數數值越大代表腸道樣品中物種總數越多，Shannon指數越高代表腸道樣品中菌群多樣性越高。由表4 可知，3 個試驗組腸道樣品中物種總數相比對照組均有不同程度升高，腸道菌群多樣性均高于對照組，但差異不顯著。

表4 不同處理組凡納濱對蝦的腸道菌群多樣性指數

2.3.2 凡納濱對蝦腸道細菌群落主坐標分析（PCoA 分析） PCoA 分析是一種降維排序方法，可以對樣本進行分類，進一步展示樣品間物種多樣性差異。圖1 結果顯示，各試驗組對蝦腸道菌群結構較對照組有明顯的結構差異。

圖1 對蝦腸道細菌群落PCoA 分析

2.3.3 凡納濱對蝦腸道細菌群落操作分類單元（OTU）聚類的Venn 圖 通過分析表明，各組對蝦腸道菌群的共有OTUs 為131 種，其中對照組特有的OTUs 為1 種，5%、10%和20%替代組特有的OTUs 分別為0、1、7 種。各組中OTUs 分別為136、139、151、157 種（圖2），分別占總體的84.47%、86.33%、93.78%、97.51%，與α多樣性分析結果一致。

圖2 腸道細菌群落OTU 的Venn 圖

2.3.4 凡納濱對蝦腸道菌群結構分析 由表5 和圖3 可以發現，凡納濱對蝦腸道優勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroides），二者豐富度之和大于88%。以5%～20% 的生物飼料伴侶替代部分基礎日糧飼喂凡納濱對蝦，其腸道菌群中變形菌門和厚壁菌門（Firmicutes）的占比降低，其中10%替代組變形菌門占比、5%替代組和20%替代組厚壁菌門占比均顯著低于對照組；試驗組擬桿菌門和疣微菌門（Verrucomicrobia）占比增加，但組間差異不顯著。

圖3 不同飼喂組凡納濱對蝦腸道菌群門水平物種組成

表5 不同飼喂組凡納濱對蝦腸道主要菌門相對豐度 %

進一步分析屬水平菌群結構發現，以5%～20% 的生物飼料伴侶替代部分基礎日糧，凡納濱對蝦腸道菌群中Formosa屬占比均顯著高于對照組，且弧菌屬（Vibrio）占比顯著低于對照組。對蝦腸道菌群中其他3 個優勢菌屬——Spongiimonas屬、Ruegeria屬、Thalassobius屬中，除20%替代組Thalassobius屬占比顯著高于對照組，其他組與對照組相比均無顯著性差異（表6，圖4）。

圖4 不同飼喂組凡納濱對蝦腸道菌群屬水平物種組成

表6 不同飼喂組凡納濱對蝦腸道主要菌群變化 %

3 討 論

3.1 生物飼料伴侶對凡納濱對蝦生長指標的影響 生物飼料伴侶含有益生菌和酶，能夠通過促進食物消化、提高飼料利用率、促進營養物質吸收等多種途徑來提高動物的生長性能[8]。本研究結果顯示，使用生物飼料伴侶替代部分基礎日糧對凡納濱對蝦的生長性能有積極影響，試驗組均能在不影響成活率的前提下提高凡納濱對蝦的增重率、特定增長率并降低餌料系數，其中替代量為10% 最為明顯，與對照組具有顯著性差異。本研究中的生物飼料伴侶是以丁酸梭菌、枯草芽孢桿菌、蛋白酶、木聚糖酶為主的菌酶制劑經冷制粒而成，其中丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌通過改善腸道形態等來提高機體對營養物質的吸收能力進而實現促生長功能；丁酸梭菌能夠發酵腸道內的飼料并產生腸道上皮細胞生長所需的能量物質——短鏈脂肪酸（SCFA），顯著提高凡納濱對蝦的絨毛長度、杯狀細胞高度、寬度和皺襞高度，增加腸壁厚度，使對蝦腸道絨毛和邊緣更加清晰、細胞組織排列更加緊密，進而促進凡納濱對蝦腸道健康[9-11]。芽孢桿菌能夠與病原菌競爭生存位點來抑制病原菌的生長，并且能夠產生蛋白酶、幾丁質酶、消化酶進而提高凡納濱對蝦的腸道穩定性和消化系統[12-13]。

3.2 生物飼料伴侶對凡納濱對蝦非特異性免疫指標的影響 凡納濱對蝦缺乏特異性免疫，因此其免疫系統由一系列體液免疫因子組成[14]。SOD 具有清除生物體內活性氧自由基、保護細胞免受氧化損傷的功能，而ACP和AKP 則是動物體內參與免疫防御的重要水解酶[15-16]。李軍亮[17]在低魚粉飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌能夠顯著提升凡納濱對蝦體內ACP 酶含量；胡毅[18]在飼料中添加復合益生菌能夠顯著提升SOD 酶活且其提升能力優于單一添加菌。He[19]發現在飼料中添加蠟樣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌和丁酸梭菌能夠顯著提高石斑魚的免疫酶活及生長性能。本試驗發現，試驗組ACP 與AKP 酶活較對照組顯著升高；除5%替代組SOD 活力與對照組無顯著性差異外，其他試驗組均顯著高于對照組，且酶活都隨替代量的增加而升高，說明生物飼料伴侶替代部分基礎日糧可提高對蝦非特異性免疫能力，與上述文獻結果相似。

3.3 生物飼料伴侶對凡納濱對蝦腸道菌群的影響 腸道微生物及其菌群結構的變化對凡納濱對蝦生長具有重要影響，與腸道營養吸收、胃腸發育及腸道免疫有著密切聯系。本試驗中試驗組對蝦的Shannon 指數的升高及Simpson 指數的降低，說明腸道細菌區系的多樣性和穩定性提高，與孫振麗[20]報道的健康對蝦較發病對蝦腸道菌群多樣性高的結果相比，說明本研究中試驗組對蝦抗病能力增強。生物飼料伴侶中含有的枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對凡納濱對蝦腸道健康起正向調控。據報道，枯草芽孢桿菌能夠提升對蝦腸道菌群多樣性，且對弧菌屬等潛在致病菌存在抑制作用[21]；丁酸梭菌能夠通過產生丁酸降低腸道內pH、修復腸黏膜、抑制腸道炎癥的發生，同時丁酸梭菌作為腸道土著菌能夠促進有益菌的增殖，進而提高機體免疫能力[22-23]。本試驗結果表明，在腸道菌群方面以生物飼料伴侶替代部分基礎日糧，凡納濱對蝦腸道γ 變形菌綱占比相比對照組明顯下降，其中10%替代組相比降低14.19%，同時顯示出對弧菌屬占比有明顯的抑制效果，10% 替代組相比降低13.91%；擬桿菌門在試驗組腸道微生物占比上升，10%替代組中擬桿菌門占比上升16.12%，同屬于擬桿菌門的Formosa屬菌株占比上升。

4 結 論

本試驗條件下，以生物飼料伴侶替代部分基礎日糧可顯著提高凡納濱對蝦的生長性能，增強機體的非特異性免疫力，提高凡納濱對蝦腸道細菌群落區系多樣性和穩定性，對凡納濱對蝦腸道有害菌群有一定的抑制作用。綜合考慮成本和效果，推薦采用10% 生物飼料伴侶替代基礎日糧。