植物乳桿菌+菊粉合生元緩解DSS 誘導小鼠潰瘍性結腸炎的研究

張 楨，高擎燏，崔雷鴻，朱曉峰，朱崇淼*，杭蘇琴*

（1.南京農業大學動物科技學院，國家動物消化道營養國際聯合研究中心，江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室，南京農業大學消化道微生物研究室，江蘇南京 210095；2.南京致潤生物科技有限公司，江蘇南京 211200）

癥性腸?。↖nflammatory Bowel Diseases，IBD）主要包括潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's Disease，CD），其中UC 引起病變處黏膜充血、潰爛，臨床表現為腹瀉和血便[1]?？股刂委烾C 易出現耐藥性，長期服用抗生素可能增加CD 的患病概率[2]。因此，安全無副作用的微生態制劑受到極大關注。微生態制劑主要包括益生菌、益生元和合生元，其中益生菌能調節腸道菌群，而益生元可為益生菌提供營養底物[3]。研究表明，益生菌與益生元組合成的合生元能促進腸道微生態平衡[4]，如嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌與菊粉組成的合生元能有效緩解小鼠結腸炎癥，并提高腸道有益菌屬比例[5-6]，但不同微生態制劑治療UC的效果有很大差異[7]。因此，有必要通過動物試驗對微生態制劑的療效進行驗證。

本實驗室前期體外研究表明，植物乳桿菌L47+菊粉組合能夠提高體外模擬豬結腸發酵環境中有益菌屬的比例和短鏈脂肪酸的水平[8]，因此推測該組合可能有緩解UC 的作用。葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）誘導的結腸炎是國際公認并被廣泛應用的實驗性UC 動物模型，其病理改變和人體結腸炎臨床癥狀及其相似。因此，本研究利用DSS 誘導的結腸炎小鼠探究植物乳桿菌L47+菊粉合生元對結腸炎的作用，為其將來應用于生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及預處理 32 只體重（39.79±0.23）g 的8 周齡雄性ICR 小鼠購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場。菊粉的純度≥90%，聚合度為32～34；DSS 的分子量為40 000。菊粉和DSS 均購自青島源葉生物有限公司。植物乳桿菌L47+菊粉合生元制備：將實驗室自行分離保存于-20℃的植物乳桿菌菌株接種于MRS 培養基中，37℃傳代2 次后于6 000 r/min 離心15 min，收集菌體并重懸至含2%菊粉的無菌水中（109CFU/mL），用于后續小鼠灌胃。

1.2 試驗設計 本試驗在南京農業大學動物科技學院動物房進行，將32 只小鼠隨機分為對照組、DSS 組、合生元組及合生元+DSS 組，每組8 只，飼喂基礎飼料，自由飲水，適應期7 d 后開始正式試驗。對照組和DSS組小鼠每日灌胃200 μL 生理鹽水，合生元組與合生元+DSS 組小鼠每日灌胃200 μL 合生元溶液；第15 天開始在DSS 組與SD 組小鼠飲水中添加3% DSS（w/v），第21 天，小鼠禁食6 h 后斷頸處死，采集血液、結腸組織以及結腸食糜等樣品，用于指標測定和分析。

1.3 生長性能及組織器官測定

1.3.1 生長性能 每日16:00 對小鼠稱重，記錄給料量和剩料量，計算每日采食量。

1.3.2 結腸長度和重量 處死小鼠后，剪取從盲腸末端至肛門整段結腸腸段，測定長度并稱重，做好記錄。

1.3.3 脾臟重量 處死小鼠后，剪取脾臟，稱重并記錄。

1.4 小鼠結腸組織學形態評分 剪取小鼠結腸腸段約0.5 cm，用生理鹽水清洗干凈，于4%多聚甲醛中固定，72 h 內進行包埋以及石蠟切片[9]。對固定的結腸腸段進行常規HE 染色（武漢塞維爾公司），于正置顯微鏡下對結腸狀態觀察和評分，評分標準[10-11]如表1 所示。

表1 小鼠結腸形態組織學評分

1.5 小鼠結腸菌群的定量分析和代謝產物測定

1.5.1 結腸菌群的定量分析 使用實時熒光定量PCR 絕對定量結腸食糜微生物中總菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的數量，所用微生物的引物序列如表2 所示（上海凌恩生物有限公司），反應條件和反應體系嚴格按照說明書操作。

表2 菌群熒光定量PCR 和TLR4 基因引物序列

1.5.2 微生物代謝產物SCFA 的測定 參照秦為琳[12]的方法使用氣相色譜（Shimadzu GC-2014，日本）檢測樣品中短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acid，SCFA）濃度。

1.6 小鼠結腸組織TLR4 及血清中炎癥因子含量的測定

1.6.1 TLR4 基因表達的測定TLR4基因和持家基因引物序列如表2 所示，反應條件和反應體系嚴格按照公司提供的說明書進行。每個樣本重復測定3 次，取CT 的平均值，根據公式2-ΔΔCT計算各基因的相對表達量。

1.6.2 血清炎癥相關細胞因子的測定 采屠宰前眼眶靜脈血，室溫靜置4 h，3000 r/min 離心15 min，取上層血清，分裝至1.5 mL 離心管中，-20℃冰箱保存。嚴格按照試劑盒（南京奧青生物有限公司）說明書測定血清中IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α含量。

1.7 統計分析 數據以平均值± 標準誤表示，采用SPSS 24.0 的單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較差異顯著性。采用GraphPad prism 8.0.2 軟件作圖。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 合生元對小鼠生長性能的影響 如圖1 所示，與對照組相比，DSS 組小鼠體重和采食量均降低（P＜0.05），體重下降率超過7%，采食量下降超過2 g/d；與DSS組相比，合生元+DSS 組小鼠的體重和采食量均升高（P＜0.05）。

圖1 合生元對小鼠生長性能的影響

如表3 所示，與對照組和合生元組相比，DSS 組、合生元+DSS 組小鼠結腸長度均縮短（P＜0.05），而合生元+DSS 組小鼠結腸長度較DSS 組增加（P＜0.05）；結腸重量各組之間差異不顯著；相較于對照組，DSS組小鼠脾臟平均重量增加了0.12 g（P＜0.05），合生元組、合生元+DSS 組小鼠脾臟重量較DSS 組均下降（P＜0.05）。

表3 合生元對小鼠結腸長度、結腸和脾臟重量的影響

2.2 合生元對小鼠結腸組織學形態的影響 由圖2 可知，對照組與合生元組小鼠結腸上皮細胞絨毛發育較好，隱窩和腺體正常，未發生炎癥細胞浸潤；與對照組相比，DSS 組小鼠結腸黏膜上皮結構破壞嚴重，杯狀細胞壞死，隱窩消失；與DSS 組相比，合生元+DSS 組小鼠結腸黏膜上皮結構的受損狀況得到緩解，可見少量炎癥細胞浸潤，黏膜組織結構相對完整。

圖2 合生元對結腸炎小鼠結腸黏膜組織形態的影響

如表4 所示，對照組與合生元組小鼠平均結腸組織學評分分別為0.2 和0.1，均未出現明顯組織學損傷，DSS 組小鼠組織學評分升高到3.3（P＜0.05），表明DSS 組小鼠結腸組織受到嚴重損傷；與DSS 組相比，合生元+DSS 組小鼠結腸組織學評分下降至2.1（P＜0.05）。

表4 合生元對結腸炎小鼠結腸組織形態組織學評分的影響

2.3 合生元對小鼠結腸食糜菌群和代謝產物的影響 由表5 可見，各組小鼠結腸總菌數量無顯著差異；與對照組相比，DSS 組小鼠結腸乳酸桿菌數量降低（P＜0.05），大腸桿菌數量增加（P＜0.05）；與DSS 組相比，合生元+DSS 組小鼠結腸乳酸桿菌數量有所提升（P＞0.05），大腸桿菌數量降低（P＜0.05）。

表5 合生元對小鼠結腸菌群和短鏈脂肪酸的影響

與對照組相比，DSS 組小鼠結腸食糜中丁酸以及總短鏈脂肪酸濃度下降（P＜0.05）；與DSS 組相比，合生元+DSS 組小鼠結腸食糜的乙酸、丁酸以及總短鏈脂肪酸濃度上升（P＜0.05）。

2.3 合生元對小鼠結腸組織TLR4基因表達及血清炎癥因子的影響 由表6 可知，經DSS 刺激后，DSS 組小鼠結腸組織中TLR4基因的相對表達量較對照組顯著升高；與DSS 組相比，合生元+DSS 組小鼠結腸組織中TLR4基因的相對表達量顯著下降。與對照組相比，DSS 組小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α含量均顯著增加；與DSS 組相比，合生元+DSS 組的IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α含量均顯著下降。

表6 合生元對小鼠結腸組織TLR4 基因表達量和血清炎癥因子含量的影響

3 討 論

Kim 等[17]指出，無論使用抗生素還是其他藥物，對結腸炎小鼠的影響首先會反映在小鼠的體重、采食量上，因此本研究首先關注小鼠體重和采食量的變化。本研究結果顯示，DSS 組小鼠體重下降率達7%，而合生元+DSS 組小鼠體重下降率為4.5%左右，且采食量較DSS 組提高近1 g/d，這表明植物乳桿菌L47+菊粉能夠緩解DSS 所引起的體重與采食量降低。而且植物乳桿菌L47+菊粉能顯著改善DSS 所導致的結腸縮短。賀慶芝等[18]研究發現，結腸長度與結腸炎嚴重程度呈負相關，這可能是因為結腸炎引起的結腸充血和病變而導致結腸縮短。相比于對照組，DSS 處理顯著提高了脾臟重量。脾臟是機體重要的免疫器官，可能與DSS 激活機體免疫系統，從而導致脾臟功能活躍和其重量增加[19]，而植物乳桿菌L47+菊粉則緩解了這一癥狀。此外，小鼠結腸組織切片結果顯示，SD 組結腸組織學評分顯著低于DSS 組，這表明植物乳桿菌L47+菊粉對DSS 誘導的小鼠結腸黏膜損傷具有保護作用。Yang 等[20]研究表明，植物乳桿菌能夠顯著改善Escherichia coli K88攻毒造成小腸絨毛高度縮短、隱窩深度增加等腸黏膜損傷的問題，這也本研究結果一致。

結腸炎可導致腸道菌群結構失調。本研究菌群定量結果顯示，與對照組相比，DSS 組結腸乳酸桿菌數量顯著降低，大腸桿菌數量顯著升高；而合生元+DSS 組乳酸桿菌數量較DSS 組顯著提高，大腸桿菌數量降低，說明植物乳桿菌L47+菊粉組合促進了有益菌的增殖，抑制了病原菌的生長。合生元可通過多種途徑抑制腸道病原菌的增殖，其中包括促進乳酸菌增殖而產生大量乳酸降低pH 形成一個抑制病原菌如大腸桿菌等生長的酸性環境，從而保護動物腸道健康[21]。此外，Vinolo 等[22]研究發現結腸炎可引起腸道短鏈脂肪酸濃度下降。本研究結果顯示，合生元+DSS 組乙酸、丁酸以及總短鏈脂肪酸濃度顯著高于DSS 組，說明植物乳桿菌L47+菊粉能夠調節腸道菌群結構，促進短鏈脂肪酸的生成。這可能與乳酸菌數量增加有關，因為乳酸菌除了產生乳酸還可以促進SCFAs 的產生，其中包括乳酸含量的增加為丁酸產生菌提供了底物來源，從而促進丁酸含量增加[23-24]。

腸內穩態受到Toll-like 受體（Toll-like Receptors，TLRs）的調控，它們在微生物病原和調節先天免疫系統中發揮著重要作用。其中TLR4 是研究最為廣泛的受體之一，它主要通過識別大腸桿菌等革蘭氏陰性菌外膜的結構成分LPS 而激活炎癥信號通路，其中最主要的是以NF-kB 為中心的炎癥信號通路[25]。被激活的NF-κB 調控一系列免疫炎癥反應相關的基因轉錄，觸發腸道炎癥介質如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 以及TNF-α、IFN-γ、黏附分子蛋白等細胞因子，導致腸道黏膜組織炎癥損傷[26]。研究表明，TLR4在正常人體腸道黏膜中少量表達，但在UC 患者或UC 模型小鼠的腸黏膜中其表達大幅提高[27]。本研究結果顯示，相比于DSS 組，合生元+DSS 組TLR4 的mRNA 表達上調，血液促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α水平降低，這表明植物乳桿菌L47+菊粉能減輕腸道黏膜的炎癥反應，可能與植物乳桿菌L47+菊粉引起結腸短鏈脂肪酸濃度的改變有關。眾多研究均表明短鏈脂肪酸具有抗炎作用。Tedelind 等[28]研究發現，短鏈脂肪酸可以抑制人結腸細胞系TLR4介導的NF-κB 激活，其抗炎作用為丁酸＞丙酸＞乙酸；Fukuda 等[29]也發現乙酸可緩解小鼠大腸桿菌攻毒所引起的腸道炎癥。

綜上所述，植物乳桿菌L47+菊粉可能是通過提高小鼠結腸乳酸桿菌數量及短鏈脂肪酸濃度，抑制大腸桿菌等病原菌的生長，降低TLR4基因的相對表達以及IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α等促炎因子的分泌，從而一定程度緩解小鼠結腸炎癥，具有應用于生產實踐的潛力。