葉酸對產蛋雞血液免疫指標和腸道屏障功能的影響

武笑天，溫 曌，李銳瑞，白 彥，王 瑞，楊 玉

（山西農業大學動物科學學院，山西太谷 030801）

葉酸被認為是畜禽生長必須從飼料中獲取的一種B 族維生素，NRC（1994）建議參考蛋雞中葉酸添加水平為0.55 mg/kg，我國《蛋雞復合預混合飼料》（GB/T 22544-2008）建議整個產蛋期蛋雞葉酸添加量≥0.25 mg/kg。腸道不僅是營養物質吸收的主要場所，也是保護機體不受致病菌影響的重要防線，其健康發育對家禽至關重要。腸道機械屏障是由腸黏膜上皮細胞及其緊密連接等組成的完整的腸上皮細胞[1]。腸道化學屏障主要是指覆蓋在腸上皮細胞的黏液層。黏蛋白2（MUC2）是由杯狀細胞分泌的形成小腸黏液層的主要黏蛋白，可作為評價腸道健康狀態的重要指標之一[2]。腸道免疫屏障通過分泌型免疫球蛋白A（SIgA）等阻止細菌和毒素侵入[3]。研究表明，葉酸能夠提高畜禽的生產性能[4-6]，對蛋品質無影響[7-8]。雛雞的生產性能和免疫力隨飼糧葉酸含量的提高而增強，以1.0 mg/kg 時最高[9]。研究表明添加15 mg/kg 葉酸有提高仔豬血清免疫球蛋白G（IgG）含量的趨勢[10]。添加150 μg 葉酸能夠提高肉仔雞血清IgG 和免疫球蛋白M（lgM）抗體水平[11]。王寶維等[12]研究表明，4 周齡鵝的飼糧中葉酸水平為1.60 mg/kg 時，IgG 比對照組提高了67.33 μg/mL。目前，本課題組研究發現，飼糧中添加葉酸，對蛋雞生產性能無顯著影響，但可以緩解產蛋雞產蛋高峰期產蛋率自然下降幅度，顯著提高其抗氧化能力；回歸分析表明，飼料中葉酸的適宜添加量為3.75～6.40 mg/kg（未發表）。但有關葉酸對蛋雞腸道屏障功能的研究還處于空白。本試驗旨在研究飼糧中添加不同水平的葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞血液免疫指標及腸道屏障功能的影響，為生產富葉酸雞蛋提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與日糧 試驗選擇 648 只30 周齡健康狀況良好、體重相近處于產蛋高峰期的京紅蛋雞，隨機分成6 處理，每處理6個重復，每重復18只雞。采用單因素試驗設計，分別在基礎飼糧中添加1、3、6、12、24 mg/kg 葉酸，對照組飼喂基礎飼糧（葉酸含量為0.35 mg/kg），基礎飼糧參考京紅蛋雞營養標準并結合生產實際配制，其組成及營養成分見表1。葉酸由河北科泰生物科技有限公司提供，其有效成分95.5%～102.0%。試驗預試期2 周，正試期6 周。

表1 基礎飼糧組成及營養成分（風干基礎）

1.2 飼養管理 采用3 層階梯式籠養，每籠3 只雞，連續的6 籠為1 個重復，各重復均勻分布于雞舍同行中間2 層。全程粉料飼養，每天光照時間為16 h，雞舍溫度控制在25℃左右，自由飲水，每天喂食2 次（09:00、15:00），自然通風和縱向負壓通風相結合。其他均按養殖場常規方法進行。

1.3 樣品采集處理與指標測定

1.3.1 血清生化指標測定 試驗期末空腹稱重后，各重復隨機選擇1 只雞，每組6 只雞，使用不加抗凝劑的真空采血管翅靜脈采血10 mL，靜置分層，待血清大量析出后，吸取血清于離心管中，3 000 r/min 離心10 min，上清液分裝到多個0.5 mL 離心管中，-20℃保存待用。送往上海酶聯生物科技有限公司用ELISA 試劑盒測定血清中內毒素（ET）、二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）、IgA、IgG、IgM 等相關血清指標。

1.3.2 腸道形態結構測定 雞采血后，屠宰分離十二指腸、空腸、回腸，在各腸道中段剪下約1 cm 的腸段，用0.9%的生理鹽水洗凈后放入4%甲醛固定液中固定，固定好的腸組織經脫水-石蠟包埋-連續切片-蘇木精-伊紅染色，采用光學顯微鏡觀察腸道，并以圖像軟件Image-Pro Plus 軟件測量絨毛高度（Villus Height，VH）、隱窩深度（Crypt Depth，CD），計算絨隱比（絨毛高度/隱窩深度，VH/CD），每個樣本觀察2 個非連續切片，每張切片選取3 個視野，每個視野分別測定10 組數據，取平均值作為1 個測定數據。

1.3.3 腸道屏障功能相關基因表達量測定 采用Trizol法分別提取十二指腸、空腸和回腸組織總RNA。用核酸蛋白儀測定RNA 完整性、濃度和純度。按照TaKaRa 反轉錄試劑盒說明合成cDNA，保存于-20℃。以cDNA 為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMII 試劑盒說明，在實時熒光定量PCR 儀上進行，反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環。目標基因閉合蛋白-1（Claudin-1）、閉鎖蛋白（Occludin）、閉合小環蛋白-1（ZO-1）、MUC2、SIgA、TOLL 樣受體4（TLR4）、核轉錄因子-κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-13（IL-13）基因和內參基因β-actin的引物序列見表2，由上海生物工程公司合成引物。采用相對定量分析法，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA 相對表達量。

表2 目的基因引物序列

1.4 統計分析 利用Excel 2010 軟件初步整理數據，應用SPSS 22.0 統計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），用Duncan's 法比較組間差異顯著性，并對相應的數據進行線性和二次曲線回歸分析。結果以平均值和標準誤（SEM）表示。P＜0.05 表示差異顯著，0.05≤P＜0.10 表示有趨勢，使用Graph Pad Prism 8 軟件作圖。

2 結果

2.1 葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞血清免疫球蛋白含量的影響 由表3 可知，飼糧中添加葉酸對IgG 含量無顯著影響；6 mg/kg 組IgA 和IgM 含量均高于對照組（P＜0.05）、1 mg/kg 組（P＜0.05），與12、24 mg/kg組無顯著差異。IgA 和IgM 含量隨葉酸水平的升高均呈二次曲線反應（P＜0.05），其中6 mg/kg 組IgA 和IgM含量最大，分別為212.67、545.21 μg/mL。

表3 飼糧中添加葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞血清免疫球蛋白含量的影響 μg/mL

2.2 葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞腸道屏障功能的影響

2.2.1 葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞腸道組織形態的影響由表4 可知，6 mg/kg 組十二指腸VH 高于其余各組（P＜0.05）；1、6、24 mg/kg 組空腸VH 高于對照組、12 mg/kg 組（P＜0.05），6 mg/kg 組空腸VH/CD 高于對照組、12 mg/kg 組（P＜0.05），而對其他各組無影響。飼糧中添加葉酸有增加十二指腸VH/CD 的趨勢，對回腸VH、CD 及VH/CD 均無顯著影響。隨著葉酸水平的升高，十二指腸VH 呈二次曲線反應（P=0.066），6 mg/kg 組最大，為1 805.26 μm。

表4 飼糧中添加葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞腸道組織形態的影響

2.2.2 葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞腸道緊密連接蛋白和MUC2mRNA 表達量的影響 由表5 可知，飼糧中添加6 mg/kg 的葉酸，十二指腸OccludinmRNA表達量高于對照組、1、3 mg/kg 組（P＜0.05），ZO-1 mRNA 表達量高于其余各組（P＜0.05）；飼糧中添加葉酸對十二指腸Claudin-1 mRNA 表達量無顯著影響；3、6mg/kg 組MUC2mRNA 表達量高于除12 mg/kg 組外的其余各組（P＜0.05）。飼糧中添加葉酸增加了空腸Occludin、Claudin-1、ZO-1、MUC2和回腸Occludin、ZO-1mRNA 表達量（P＜0.05），其中6 mg/kg 組最高。飼糧中添加葉酸增加了MUC2mRNA 表達量（P＜0.05），其中12 mg/kg 組最高，添加葉酸有增加回腸Claudin-1mRNA 表達量的趨勢（P=0.057）。十二指腸Occludin、Claudin-1、MUC2和空腸Occludin及回腸Occludin、ZO-1、MUC2mRNA 表達量呈二次曲線反應（P＜0.05），其中3 mg/kg 組和12 mg/kg 組十二指腸和回腸MUC2mRNA 表達量最大，分別為1.54、1.60；其余均以6 mg/kg組最大，分別為1.85、1.49、1.71、1.40、1.91。

表5 飼糧中添加葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞腸道緊密連接蛋白、MUC2 mRNA 表達量的影響

2.2.3 葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞血清DAO 活性、D-LA和ET 含量的影響 由表6 可知，3、6 mg/kg 組的D-LA 濃度低于對照組、1、24 mg/kg 組（P＜0.05）；6、12 mg/kg 組DAO 濃度低于對照組、3、24 mg/kg 組（P＜0.05）；12 mg/kg 組ET 濃度低于除6 mg/kg 組的其余各組（P＜0.05）。隨著葉酸水平的升高，D-LA、DAO、ET 濃度均呈二次曲線反應（P＜0.05）。其中D-LA、DAO 濃度以 6 mg/kg 組最小，分別為43.63 μmol/mL、14.34 U/mL；ET 濃度以12 mg/kg 組最小，為45.81 ng/mL。

表6 飼糧中添加葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞血清DAO 活性、D-LA 和ET 含量的影響

2.2.4 葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞腸道免疫細胞因子mRNA 表達量的影響 由圖1、圖2、圖3 可知，6、12 mg/kg 葉酸組十二指腸和空腸SIgAmRNA 表達量高于對照組、1 mg/kg 組（P＜0.05）。6、12、24 mg/kg組十二指腸NF-κBmRNA 表達量低于對照組（P＜0.05）；6 mg/kg 組TNF-αmRNA 表達量低于對照組、12、24 mg/kg 組（P＜0.05）；飼糧中添加葉酸降低了十二指腸TLR4mRNA 表達量（P＜0.05）、增加了IL-10 和IL-13 mRNA 表達量（P＜0.05）。飼糧中添加葉酸降低了空腸TLR4、NF-κBmRNA 表達量（P＜0.05），增加了IL-10 mRNA 表達量（P＜0.05）；3 mg/kg 和6 mg/kg組IL-1βmRNA 表達量低于其余各組（P＜0.05）。飼糧中添加葉酸降低了回腸TNF-αmRNA 表達量（P＜0.05），降低了除24 mg/kg組外的TLR4mRNA表達量（P＜0.05）；3、6、12 mg/kg 組IL-13 mRNA 表達量高于對照組（P＜0.05）。

圖1 飼糧中添加葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞十二指腸免疫細胞因子mRNA 表達量的影響

圖2 飼糧中添加葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞空腸免疫細胞因子mRNA 表達量的影響

圖3 飼糧中添加葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞回腸免疫細胞因子mRNA 表達量的影響

3 討 論

3.1 葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞血清免疫球蛋白含量的影響 IgA、IgG 和IgM 主要由B 淋巴細胞分泌，在體液免疫中起著重要作用。因此，免疫球蛋白水平的高低是動物機體免疫功能的重要標志[13]。添加葉酸能增加嘌呤和嘧啶含量，加快DNA 和RNA 合成，與維生素B12、維生素C 共同參與紅細胞和血紅蛋白的生成，促進了免疫球蛋白的生成。Erickson 等[14]研究表明，葉酸可以參與細胞先天性免疫，增加免疫器官重量，調控機體的內分泌水平，從而影響其免疫性能。葛文霞等[15-16]研究證實，葉酸水平為3.0 mg/kg 時21 日齡肉仔雞血清中IgG含量顯著提高，IgA 和IgM 沒有顯著變化。本試驗結果

表明，6 mg/kg 葉酸可顯著增加蛋雞血清中IgA 和IgM含量，卻對IgG 無顯著影響，與葛文霞等[15-16]的研究結果不一致，推測其原因可能與雞種、雞體所處生理狀態不同有關。由于母源IgG 可通過卵黃直接補充，所以雛禽在出殼后3～5 d 內始終保持較高的IgG 水平，直到7 日齡左右開始下降，20～22 日齡后基本檢測不到，這使雛禽在自身免疫系統健全以前也可以得到有效保護，且禽類各種免疫球蛋白在種系進化和個體發育中出現的時間不同。

3.2 葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞腸道屏障功能的影響

3.2.1 葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞腸道組織形態的影響小腸是營養物質消化和吸收的主要器官，也是機體防御體系的第一道屏障，在維持腸道正常營養代謝和腸道屏障功能等方面發揮著重要作用[17-18]。腸道黏膜作為家禽機體最重要的黏膜系統，其形態結構和功能的完整性是維護腸道健康的有效屏障[19]。當VH/CD 增加，腸道吸收功能和消化功能增強，腸道黏膜屏障功能得到明顯改善。本試驗中，6 mg/kg 葉酸可顯著增加十二指腸VH、空腸VH 和VH/CD，說明飼糧中適宜添加水平的葉酸有利于促進蛋雞腸道發育。其主要原因為：葉酸參與嘌呤環和脫氧核苷酸的生物合成，具有促進核酸生物合成的作用；葉酸作為一碳單位的載體，促進碳水化合物、脂肪和蛋白質的代謝；葉酸能夠提供甲基給甲基受體，使甲基受體成為甲基衍生物。

3.2.2 葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞腸道緊密連接蛋白、MUC2mRNA 表達量及腸道通透性的影響 腸道屏障的完整性能防止腸道微生物中的病原體和有害物質進入體內，同時也能維持機體內環境穩態。大量研究表明，腸道機械屏障的損傷與許多疾病的發生、發展息息相關[20-21]。緊密連接Claudin-1、Occludin、ZO-1 是腸道黏膜機械屏障的關鍵組成部分[22]，可以調節腸道屏障通透性，防止細菌和毒性大分子物質進入身體。MUC2 和Claudin-1是重要的腸上皮屏障組分，可防止有害物質到達腸上皮表面，抵御病毒和病原菌入侵。當家禽的腸黏膜緊密連接結構被破壞時，腸道通透性增大[23]，血液中ET和D-LA 含量增加[24]，DAO 活性提高，因此，血液中DAO 水平可反映腸道損傷和修復情況[25]。葉酸能一定程度上降低腸道有害菌數量、優化腸道菌群[26]，降低腸道內毒素含量，使腸黏膜受損幾率降低，防止腸上皮釋放大量的DAO 進入血液。目前仍未見葉酸影響家禽腸道通透性的研究。本試驗結果顯示，飼糧中添加6 mg/kg 和12 mg/kg 葉酸顯著增加了十二指腸、空腸和回腸Occludin、ZO-1、MUC2mRNA 表達量，顯著降低了血清ET 含量和DAO 活性，提示適量葉酸可以有效降低腸道通透性，改善家禽腸道黏膜損傷，抑制由于腸道通透性的增加而導致的內毒素移位，具體機制有待研究。

3.2.3 葉酸對產蛋高峰期京紅蛋腸道免疫屏障細胞因子mRNA 表達量的影響 腸道功能和通透性受免疫球蛋白和多種細胞因子的影響，這些炎性介質可能進入血液，然后作用于腸黏膜上皮細胞并影響腸道完整性和功能[27]。TLR4 能夠調節促炎因子IL-1β的分泌，還能通過誘導腸上皮細胞與巨噬細胞的交互作用提高抗炎因子IL-10的表達[28]，IL-1β和TNF-α能夠通過影響腸上皮細胞完整性和腸道通透性增加[29]。IL-10 不僅能抑制TLR4、NF-κB 炎癥信號反應，還能維持腸道屏障功能[30]。IL-13 能夠在體內抑制活化的T 細胞產生炎性細胞因子，抑制炎癥反應的發生。SIgA 和細胞因子等是構成腸道免疫屏障的主要組成成分[31]。腸道炎癥反應主要受細胞因子的調節。在動物機體內，TIR4/NF-κB 信號通路可調節細胞因子的產生，但在家禽體內葉酸是否通過TIR4/NF-κB 信號途徑調節細胞因子表達未見報道。本研究表明，6 和12 mg/kg 組葉酸顯著降低了十二指腸TLR4、NF-κB、TNF-α及回腸TLR4、TNF-αmRNA表達量，顯著增加了十二指腸SIgA、IL-10、IL-13 和回腸IL-13 mRNA 表達量；添加3、6 mg/kg 葉酸顯著降低了空腸TLR4、NF-κB、IL-1βmRNA 表達量，顯著增加了IL-10 mRNA 表達量，表明添加適量葉酸能夠減少促炎性細胞因子的合成量，減緩腸道中的炎性反應，保護腸道發育，且以6 mg/kg 較好。

4 結 論

本試驗結果顯示，日糧中添加6 mg/kg 葉酸提高產蛋雞血清免疫球蛋白IgA 和IgM 含量，降低D-LA、ET 含量及DAO 活性；改善十二指腸和空腸的黏膜形態，增加小腸Occludin、ZO-1、MUC2以及十二指腸中SIgAmRNA 的表達；通過抑制TLR4/NF-κB炎癥信號通路，進而抑制促炎細胞因子的表達，提高抗炎性細胞因子的表達，進而改善了腸道的屏障功能。