貴州地方豬膠原蛋白特性及相關基因組織表達研究

楊 蓉，周 迪*，燕志宏，任麗群，李 平，李 俊，趙忠海，唐華江，龍清孟，龔 菲，陳昌雪，蔣桂榮

（1.貴州省種畜禽種質測定中心，貴州貴陽 550018，2.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025；3.遵義市畜牧漁業站，貴州遵義 563000；4.貴州省草業研究所，貴州貴陽 550025）

膠原蛋白是細胞外基質（ECM）的主要成分[1]，能夠在肌肉和脂肪組織中廣泛分布并形成微細的原纖維網[2-3]。研究表明，膠原蛋白的類型有18 種之多，且其含量和交聯程度（主要指非還原性交聯，羥賴氨酰吡啶嗡（HP）和賴氨酰吡啶嗡（LP）結構，統稱為吡啶交聯）是影響肉質的關鍵因素[4-6]。膠原分子中的羥基、酰胺基及氨基等極性基團能在水中與H 鍵相結合形成凝膠，對肉的膠粘性、彈性以及咀嚼性等性狀具有重要影響；研究發現，III 型膠原蛋白是動物機體中最常見也是最主要的類型之一，其編碼的COL3A1基因由3 條α1（III）鏈組成，其mRNA 表達水平對肌肉膠原蛋白含量具有重要作用[7-8]，也對其感官性狀和肉質性狀有一定影響。賴氨酰氧化酶（LOX）是促進彈性蛋白和膠原蛋白共價交聯的關鍵酶，主要作用于細胞外基質（ECM）的膠原蛋白和彈性纖維，催化氧化ECM 中去氨基的賴氨酸和羥賴氨酸，以促進膠原蛋白分子間共價交聯，形成網狀結構，進而保持細胞外基質的完整和穩定。貴州地方豬具有皮糯肉嫩，風味極佳等優良特性，深受消費者青睞，為探索其內在原因，本研究以貴州地方豬柯樂豬、宗地花豬與杜長大雜交豬為實驗對象，探究其肌肉和脂肪組織膠原蛋白特性及相關基因COL3A1、LOX在不同組織中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品 柯樂豬、宗地花豬和杜大長雜交豬分別由赫章優農谷生態畜牧業有限公司、紫云紫薇畜牧業開發有限公司和貴州臺農興旺公司提供。隨機選取體質健康、飼喂水平相同、體重約100 kg 的柯樂豬、宗地花豬和杜大長雜交豬各3 頭進行屠宰，采集其皮下脂肪、背最長肌等組織，用0.9%生理鹽水清洗后，置于液氮中暫存，帶回實驗室至-80℃超低溫冰箱保存，備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠原蛋白含量測定 稱取0.2 g 組織樣品置于試管中，加入2 mL 6 mol/L 鹽酸提取液，100℃消化2～6 h，冷卻至室溫后，12 000 r/min、25℃離心20 min，隨后用10 mol/L NaOH 調節pH 至6～8，取上清，測定管加入待測液60 μL，加入試劑一混勻靜置20 min，加試劑二和H2O，混勻，60℃水浴20 min，室溫靜置15 min，酶標儀測定吸光值，繪制出標準曲線后計算羥脯氨酸（HYP）含量再換算成算膠原蛋白含量。

1.2.2 吡啶交聯含量測定 稱取1 g 組織樣品用PBS（0.01 mol/L,pH=7.2～7.4）沖洗，剪碎放入玻璃勻漿器底部，加入9 mL PBS 在冰上研磨，5 000 r/min 離心15 min，取上清液待測。標準孔加標準品50 μL。空白孔加樣品稀釋液50 μL；樣品孔先加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL，每孔加抗體100 μL，37℃避光孵育60 min。棄去液體，拍干，每孔加洗滌液靜置1 min 甩去液體，拍干，重復5 次。加顯色劑A 50 μL，再加顯色劑B 50 μL，混勻，避光顯色15 min。加終止液終止顯色，用酶標儀測定450 nm 波長處的OD 值。再以標準物濃度為x 軸，OD 值為y 軸，繪制出標準品線性回歸曲線，計算各樣品濃度。

1.2.3 RNA 提取和cDNA 第一條鏈合成 采用Trizol法提取組織總RNA，根據RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit 逆轉錄試劑盒實驗步驟將RNA 樣品進行逆轉錄合成第一鏈cDNA，置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.4 引物設計與合成 根據GenBank 數據庫中豬LOX、COL3A1基因mRNA 序列，采用Primer 5 軟件設計特異性熒光引物，選用GAPDH基因為內參基因，引物序列見表1，設計完畢后交由生工生物（上海）股份有限公司合成。

表1 LOX、COL3A1 基因引物信息

1.2.5 實時熒光定量PCR 用SYBR Green I 熒光染料法進行實時熒光定量PCR 實驗，總體系為10 μL，cDNA 模板1 μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，SsoFASt EvaGreen Supermix 5 μL，RNase-free ddH2O 3.2 μL。反應條件為：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃ 延伸1 min，39 個循環。熔解曲線以每5 s 上升0.5℃的速率從65℃升高到95℃。每個樣品設3 個重復。

1.2.6 數據統計分析 利用Excel 2007 軟件統計數據，并用2-ΔΔCt法計算LOX、COL3A1基因在不同豬種背最長肌和皮下脂肪的相對表達量。并用SPSS 19.0 分析軟件對實驗結果進行t檢驗和單因素方差分析，結果以平均值±標準差呈現。

2 結果與分析

2.1 羥脯氨酸標準曲線繪制 實驗得出a 值為0.039，b 值為0.118 2，帶入羥脯氨酸標準品線性回歸方程y=0.039x+0.1183，R2為0.987 7。將所測樣品ΔA（A測定管-A 空白管）的OD 值帶入方程得出x 值。

2.2 膠原蛋白含量 如圖1 所示，3 個品種皮下脂肪膠原蛋白含量均高于背最長肌組織，且在皮下脂肪和背最長肌中膠原蛋白含量均是宗地花豬最高，極顯著高于柯樂豬和杜大長雜交豬，柯樂豬含量居中，杜大長雜交豬含量最低。

圖1 不同品種和組織膠原蛋白含量（單位：μg/g）

2.3 吡啶交聯標準曲線繪制 以標準品濃度為x 軸，OD 值為y 軸建立線性回歸方程：y=kx+b，結果表明：HP 實驗所得a 值為0.22，b 值為0.095 5，帶入方程y=0.22x+0.0955，且R2=0.996 4；LP 實驗所得a 值為0.377 7，b 值為0.033 7，帶入方程y=0.3777x+0.0337，且R2=0.972 6。將所測樣品OD 值帶入方程，求出x 值。

2.4 宗地花豬、柯樂豬及杜大長雜交豬HP 含量、LP 含量差異性分析 如表2 所示，相同組織不同品種間采用單因素方差分析，對于同一品種的2 個組織間采用t檢驗。由表2 可知，對于HP 含量，在背最長肌中，宗地花豬、柯樂豬均極顯著高于杜大長雜交豬，宗地花豬和柯樂豬之間差異不顯著；在皮下脂肪中，柯樂豬含量最高，杜大長雜交豬次之，宗地花豬的含量最低，且柯樂豬顯著高于宗地花豬，杜大長雜交豬與柯樂豬、宗地花豬之間均不呈顯著關系。在同一品種不同組織中，3 個豬種皮下脂肪HP 含量均高于背最長肌，其中柯樂豬皮下脂肪HP 含量顯著高于背最長肌，宗地花豬和杜大長雜交豬皮下脂肪HP 含量均極顯著高于背最長肌。

表2 HP 含量、LP 含量比較分析結果

對于LP 指標，在背最長肌中，柯樂豬含量最高，杜大長雜交豬次之，宗地花豬最低，柯樂豬與杜大長雜交豬差異不顯著，但均極顯著高于宗地花豬；在皮下脂肪中，杜大長雜交豬含量最高，極顯著高于柯樂豬和宗地花豬，柯樂豬含量高于宗地花豬但差異不顯著。在同品種不同組織中，柯樂豬背最長肌中LP 含量極顯著高于皮下脂肪，宗地花豬背最長肌中LP 含量顯著高于皮下脂肪。

2.5LOX、COL3A基因RT-PCR 擴增結果 擬用于RTPCR 擴增引物，經梯度PCR 擴增檢測，發現目的片段大小相近，且條帶清晰、無雜帶、無引物二聚體，說明引物特異性好，可直接用于RT-PCR 擴增。

2.6 實時熒光定量PCR 結果分析

2.6.1LOX基因差異表達分析 如圖2 可知，在背最長肌中，杜大長雜交豬LOX基因表達量與柯樂豬和宗地花豬之間呈差異極顯著，宗地花豬與柯樂豬之間未達到顯著水平；在皮下脂肪組織，杜大長雜交豬極顯著高于柯樂豬和宗地花豬；對同一豬種不同組織分析結果顯示，3 個豬種皮下脂肪組織LOX基因表達均極顯著高于背最長肌組織。

圖2 LOX 基因在不同豬種組織表達水平

2.6.2COL3A1基因差異表達分析 如圖3 所示，背最長肌組織COL3A1基因在宗地花豬中表達量極顯著高于柯樂豬和杜大長雜交豬，柯樂豬次之，杜大長雜交豬最低；皮下脂肪組織COL3A1基因表達量宗地花豬顯著高于柯樂豬，極顯著高于杜大長雜交豬。同一品種不同組織分析結果顯示，皮下脂肪COL3A1基因表達量均極顯著高于背最長肌。

圖3 COL3A1 基因在不同豬種組織表達水平

3 討 論

膠原蛋白普遍存在于動物機體內的結締組織、骨骼、肌肉、內臟器官等組織中，它對肌肉生長和保持肌肉塑性具有重要作用。本研究結果顯示，在3 個豬種中，皮下脂肪膠原蛋白含量高于背最長肌組織，且宗地花豬2 個組織膠原蛋白含量高于柯樂豬和杜大長雜交豬。研究表明[10]，隨著膠原蛋白含量增加，彈性增強，表明膠原蛋白含量越高，肉質就越富有彈性。另外膠原蛋白網狀纖維結構使其具有很強的熱收縮性，且與水分子結合能力較強，這使得膠原蛋白熱溶解于水中呈凝膠狀，因此，提高膠原蛋白含量使肉質更富有粘彈性和糯性，從而提高口感豐富度和咀嚼性。有研究表明，膠原蛋白影響肌肉嫩度，其含量與嫩度呈負相關[11-13]，而梁夢帆等[14]人卻表明肌內結締組織膠原蛋白能在一定程度上保持肉的嫩度。因此，關于膠原蛋白對肌肉嫩度的影響還需進一步探究，或許膠原蛋白含量對嫩度的影響只是在動物生長的某個年齡階段。因為動物體在成熟后膠原蛋白數量不再增加，而是轉變為膠原蛋白分子間交聯程度的加強，膠原分子肽鏈之間可以形成共價交聯（偶聯）作用，主要是HP 交聯和LP 交聯，導致膠原蛋白的理化性質改變。HP 交聯和LP 交聯有很強的穩定性和機械強度，對肌肉嫩度和熱溶解性有一定影響[15-16]。在本研究中，宗地花豬、柯樂豬背最長肌中HP 濃度均高于三元雜交豬，且宗地花豬的含量最高；但在脂肪組織卻呈現與之不同的結果，宗地花豬與柯樂豬HP 含量均極顯著低于外三元雜交豬；LP 交聯在肌肉和脂肪組織中含量宗地花豬與柯樂豬均低于外三元雜交豬。Nishimura[17]曾提出脂肪沉積可破壞結締組織結構，隨著年齡增加，牛肉剪切力不再增加，且嫩度也有所改善，推測脂肪沉積破壞了結締組織結構。盧桂松等[15]研究發現，隨著脂肪沉積的增加，牛肉花紋等級提高，HP和LP 含量均有下降趨勢，據此可推測，脂肪沉積可能會導致膠原蛋白交聯結構發生改變，主要是非還原性交聯HP 和LP。本研究表明，膠原蛋白含量在宗地花豬脂肪組織中最高，但HP 和LP 交聯含量卻較低，說明其脂肪沉積量較多[18]，分子間交聯程度較小，溶解性增大，對HP 和LP 共價交聯結構形成具有抑制作用，但具體影響機制還需繼續探索。

本研究發現，COL3A1基因表達量在不同品種間存在差異，其表達量順序依次為：宗地花豬＞柯樂豬＞杜大長雜交豬；在品種內不同組織表達量也存在差異性，即在皮下脂肪COL3A1基因表達量極顯著高于背最長肌，這與組織本身膠原蛋白含量高低有一定關系。同時COL3A1基因表達趨勢與膠原蛋白含量分布有一定相關性，膠原蛋白含量較多的組織和品種其表達量較高，即COL3A1基因表達水平越高，膠原蛋白含量越多；LOX是膠原蛋白分子間形成共價交聯的關鍵性酶，其mRNA表達水平直接影響著膠原蛋白分子交聯程度，表達水平越高，HP 和LP 交聯含量越多，本實驗中LOX基因mRNA 表達量在皮下脂肪中宗地花豬最低，其交聯含量也是最低，但在肌肉卻呈現不一樣的規律，這除了與組織本身膠原蛋白含量及品種有關外，還有可能和脂肪沉積有一定關系，脂肪沉積可能對LOX基因表達具有調控作用，但具體調控機制有待進一步研究。

4 結 論

3 個豬種膠原蛋白含量皮下脂肪組織均高于背最長肌，與柯樂豬和杜大長雜交豬相比，宗地花豬2 個組織膠原蛋白含量較高，而交聯含量卻較低，HP 在皮下脂肪組織中宗地花豬顯著低于柯樂豬和杜大長雜交豬，LP 含量在背最長肌中宗地花豬含量最低，表明宗地花豬交聯含量越低，其熱穩定性差，熱溶解性較強，嫩度較好。COL3A1的表達與膠原蛋白含量呈正相關，即膠原蛋白含量越多，其表達水平越高；LOX的表達對HP和LP 交聯含量有重要影響，其表達水平越高，交聯越多，嫩度就越差。