寧都黃公雞不同冠型組織學及BMP2 表達定位研究

貢繼尚，周 敏*

（1.南昌師范學院，江西南昌 330032；2.江西省地方雞種遺傳改良重點實驗室，江西南昌 330032；3.中國科學院家禽分子育種技術聯(lián)合實驗室，江西南昌 330032）

雞冠是家禽繁殖中重要的表型性狀之一，經過長期高度自然選擇，產生多種冠型[1]。雞冠表型與生產性能具有較密切的關聯(lián)性，且雞冠發(fā)育也是衡量性成熟程度的指標[2]。因此，雞冠表型是家禽遺傳選育及繁殖育種的重要指標之一。BMP2基因是轉化生長因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族的成員之一，具有調控細胞增殖分化、凋亡、遷移以及胚胎發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)的作用[3]。目前該基因在雞冠發(fā)育過程中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。Johnsson 等[4]發(fā)現(xiàn)BMP2和羥基酸氧化酶1（Hydroxyacid Oxidase 1，HAO1）的基因間區(qū)域有一個緊密連鎖的多效性QTL，并共同影響著雞冠發(fā)育與骨骼沉積。王琨等[5]通過高通量測序及對候選基因的表達分析認為雞冠的發(fā)育與BMP2具有一定的關聯(lián)，通過分析不同周齡的雞冠中BMP2的表達，發(fā)現(xiàn)其對雞冠發(fā)育具有調控作用[6]，但是對于性成熟的公雞不同冠型中BMP2的表達研究還未見報道。在野生型雞群體中，是否具有優(yōu)質冠型是雌性作為選擇交配的先決條件，同時也是雄性在群體中等級的標志。許多研究表明，雄性對于雌性的吸引力與子代的質量具有正相關性[7]，可能是雌性更易被較大冠型的雄性吸引，以此獲得更優(yōu)秀的遺傳性狀并傳遞給子代。關于雞冠質量性狀與雞產蛋量和骨質質量等調控位點的分布都具有明顯的重疊，所以研究雞冠發(fā)育調控機制，可以間接研究家禽優(yōu)質的遺傳性狀在遺傳育種中的應用。

寧都黃雞無論公母都具有典型的早熟性[8]，并且具有多種冠型。Mukhtar 等[9]提出16 周齡公雞會出現(xiàn)性早熟現(xiàn)象，尤其是較大雞冠的公雞最明顯。本研究選取16 周齡寧都黃公雞為研究對象，通過免疫組織化學方法對6 種不同冠型的雞冠進行表達定位分析，進一步揭示BMP2 蛋白在雞冠不同表型中的作用，旨在為家禽的遺傳改良提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物來自江西省地方雞種遺傳改良重點實驗室基地（江西南師科技有限公司），為同一飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)的寧都黃公雞，共17 只。

1.2 主要試劑與儀器 4% 組織細胞固定液，DAB 顯色試劑盒，蘇木素伊紅（Hematoxylin-Eosinstaining，HE）染色試劑盒，免疫組織化學染色試劑盒（P1110，DA1010，G1120，G1120，北京索萊寶）；Anti-多克隆BMP2 抗體（GB11252，武漢塞維爾）；SLEE 半自動石蠟切片機。

1.3 實驗方法 將采集的雞冠組織置入4%組織細胞固定液中。取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 組織進行脫水、石蠟包埋和制作石蠟切片。免疫組織化學染色方法見文獻[10]。

采用Image J 計算機輔助圖像分析軟件進行細胞計數，分別選取不同冠型免疫組化切片各3 張，每張切片隨機選取5 個0.148 cm2區(qū)域，并在視野內隨機選取5個比例一致的橫截面，計算陽性細胞比例。

1.4 數據統(tǒng)計 采用SPSS 24 軟件對實驗數據進行單因素方差分析，相對表達水平和陽性細胞比率用X±SE（n=3）表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 不同冠型的雞冠發(fā)育性狀 由表1 可知，倒冠和肥厚冠冠高顯著高于其他冠型，肥厚冠冠長與其他冠型相比較長（P＜0.05），且細齒冠冠長與其他冠型相比較短（P＜0.05）。冠厚測量結果顯示，細齒冠與其他冠型相比較短（P＜0.05），其他冠型之間冠厚差異不顯著。細齒冠和齒數顯著多于正常、倒冠、肥厚、三叉冠，與雙叉冠差異不顯著。

2.2 不同冠型組織形態(tài)學變化 通過對不同冠型的比較組織學觀察（圖1），細齒冠相對于其他幾種冠型，外周層中小靜脈較少，多為管徑較小的毛細血管，血管中為單一紅細胞。在正常雞冠的外周真皮層中觀察到許多構成血管內皮細胞的大和小的毛細血管。而肥厚冠、三叉冠和雙叉冠的外周層中小靜脈呈擴大狀態(tài)，周圍的真皮層大部分被擴張的血管占據，并與鄰近的血管擴張吻合形成竇狀血管網，血管中還觀察到許多紅細胞。細齒冠的外周層和中間層都比其他冠型致密，HE 染色呈深染狀，梭型纖維細胞最為豐富，而其他冠型外周層由于膠原纖維網較多和成纖維細胞減少呈松散狀，染色呈淡染。從圖1 中觀察正常冠和倒冠中間層經染色呈透明的膠原纖維組織及粘多糖，HE 染色較淺。

圖1 寧都黃公雞不同冠型組織形態(tài)比較

2.3 BMP2 在不同冠型中的表達分布 如圖2 所示，BMP2 在不同冠型中均有表達，細齒冠陽性率極顯著高于其他冠型，且陽性率較高（圖3）。幾種冠型中BMP2 均在生發(fā)層高表達，除細齒冠BMP2 陽性表達呈由深層向淺層逐漸降低趨勢，其他幾種冠型生發(fā)層BMP2 表達均勻，陽性表達具體體現(xiàn)在真皮層的血管內皮細胞及纖維細胞中。肥厚冠與雙叉冠的血管管腔中有明顯BMP2 陽性，但與正常冠的陽性率無顯著差異。正常冠、倒冠與三叉冠中BMP2 的表達分布差異不大，但是正常冠的陽性率顯著低于三叉冠與倒冠。

圖2 BMP2 在不同冠型組織中表達的免疫組織化學染色結果

圖3 不同冠型組織BMP2 陽性比率

3 討 論

雞冠作為雞重要的表型性狀之一，與繁殖和生長等性狀具有重要聯(lián)系[11]，可作為品種選育的重要指標之一。寧都黃雞是江西省地方雞種，具有早熟性狀，在16 周齡就可以性成熟[8]。目前對于早熟型性狀的家禽雞冠組織學及對相關表型的研究未見報道。本研究通過對不同冠型性狀進行比較組織學分析發(fā)現(xiàn)，除細齒冠外，其他幾種冠型真皮層中小靜脈形成血管網，有的形成靜脈竇，管腔內紅細胞數較多，這與Yoshioka[12]觀察的結果一致；細齒冠外周層比其他幾種冠型的薄，且有豐富的纖維細胞，而其他幾種冠型外周層膠原纖維網比較疏松，尤其以正常冠與倒冠明顯。與性晚熟品種青腳麻雞26 周齡性成熟公雞雞冠組織相比[6]，雞冠中都具有豐富的血管數量網，在真皮層中膠原纖維網疏松，不同的是性早熟寧都黃雞真皮層成纖維細胞并未像青腳麻雞一樣減少，而是保持與青腳麻雞相近的數量。性早熟品種雞冠組織學特性兼具了性晚熟品種性成熟前成纖維細胞多和性成熟后膠原纖維疏松的特點。

BMP2 被認為是活性最強的成骨因子[13]，并可影響雞冠的發(fā)育。王琨[5]和Liu[14]等通過轉錄組測序技術鑒定出BMP2參與雞冠發(fā)育并對其進行了群體驗證，發(fā)現(xiàn)BMP2基因在高冠和矮冠組織中差異表達，在較大群體的定量分析中發(fā)現(xiàn)矮冠中表達量要顯著高于高冠組，本實驗發(fā)現(xiàn)細齒冠顯著低于其他冠型，并且BMP2的表達顯著高于其他高冠冠型，雞冠表面具有明顯的角質層，BMP2 在矮冠中高表達具有明顯的促進角化的作用，而角化過程中也存在鈣化。BMP2 是成骨因素中重要的因子，對成骨細胞鈣化具有重要意義，從側面說明細齒冠BMP2 的高表達使組織逐漸趨近于角質化。相對于矮冠，高冠組織中BMP2 呈低表達，在雞冠外周層及中心層的纖維細胞中具有少量的表達，并形成多樣的高冠冠型，說明BMP2 高表達對于雞冠的生長起到抑制作用，可形成低矮的細齒冠。推測是由于BMP2 過于集中的表達對于雞冠的角質化過程具有促進作用，而高表達對于雞冠分化發(fā)育方面起到了負調控作用。有實驗表明BMP2 可以對牛主動脈內皮細胞的增殖及管腔形成發(fā)揮作用[15]，成熟個體的新血管形成是通過內皮細胞產生的各種蛋白酶破壞血管基底膜或其周圍環(huán)境的細胞外基質而開始的，隨后，血管內皮細胞進行遷移和增殖。本實驗發(fā)現(xiàn)BMP2 在雞冠血管內皮細胞及纖維細胞中均有表達，可能是BMP2 通過調節(jié)內皮細胞的增殖，對維持外周真皮層的血管穩(wěn)態(tài)具有一定影響，這也可能是造成雞冠膨大的因素之一。作為內皮細胞中的主要信號傳導途徑之一，BMP 途徑十分復雜，結合的配體數量較多，功能具有多樣性，會激活不同程度的細胞內信號傳導并形成級聯(lián)反應[16]。雞冠屬于皮膚衍生物，并且血管比較豐富，可以直接表現(xiàn)環(huán)境變化帶來的應激，并不斷產生一定的表型，這種復雜的途徑對于內皮穩(wěn)態(tài)以及對正常應激源和異常應激源的響應都是必不可少的。在應激過程中，BMP2 作為疏水性酸性分泌性糖蛋白[17]，通常會增加和誘導內皮的運動性和侵襲，并通過促進增殖來引起血管生成[18]。實驗結果中發(fā)現(xiàn)血管腔中BMP2也有微量表達，這可能是由于內皮細胞中表達的BMP2通過分泌作用進入到血管腔中，作用于血管腔結構，管腔經歷反復的發(fā)芽和吻合然后形成新血管網絡，可能對竇狀血管網的形成具有促進作用，間接對雞冠的形成起到了塑形的影響。

4 結 論

細齒冠不同于其他冠型，真皮層中主要是以致密的纖維細胞為主，而其他冠型真皮層中生發(fā)層具有較多的竇狀血管網，且外周層多膠原纖維，呈松散狀。BMP2的高表達對雞冠的分化發(fā)育具有負調控作用，且對雞冠的血管分化具有一定影響，從而影響雞冠組織中血管網的形成以及雞冠多叉、高低及肥厚的表型等。本研究結果將為早熟性狀家禽的遺傳選育提供理論依據。