利用生物信息方法尋找與綿羊脂代謝相關的候選基因

肖 成，薛佳佳,2，王 晶,3，柳儉強，于永生，張立春，馬惠海，金海國*，曹 陽*

（1.吉林省農業科學院，吉林公主嶺 136100 2.吉林農業大學動物科技學院，吉林長春 130000；3.延邊大學農學院，吉林延吉 133000）

隨著居民生活水平的提高，高品質羊肉越來越受到歡迎。遺傳因素是影響肉質性狀的重要因素之一，提高肌內脂肪含量能夠顯著提升肉質，而肌內脂肪含量受到脂肪細胞分化及脂滴積累的影響。因此，探究脂肪細胞分化形成的機制，尋找新的調控基因對于提高肌內脂肪含量有重要作用。

參與綿羊脂代謝的基因眾多且復雜，不易找到相關的新調控基因，需借助生物信息學方法進行尋找。第2代測序技術可以高效準確地檢測特定狀態下細胞或組織全部的轉錄本信息，因此適合研究不同組織器官或發育階段之間的差異表達基因[1]。目前，第2 代測序技術快速發展并已被廣泛應用，大量測序數據被上傳到公共平臺。利用公共數據庫進行數據挖掘，可以快速尋找到與脂代謝相關的預測基因。通過動物實驗驗證，可以快速鎖定脂代謝相關候選基因，減少大量前期工作，縮短實驗時間。本實驗通過生物信息相關網站及分子實驗結合方式，探究影響綿羊脂肪細胞分化的新標志基因，以期為深入探索綿羊脂代謝調控機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗選擇2 月齡健康雄性綿羊（雙乾肉羊）1 只，屠宰后取其腹股溝脂肪組織，用于分離綿羊前體脂肪細胞。選擇體重相近（50 kg）的6 月齡健康雄性綿羊（杜寒雜交羊子一代）8 只，屠宰后取其肌肉、脂肪、十二指腸、小腸、心、肝、胃組織，置于凍存管中液氮保存，用于提取組織總RNA。實驗動物為吉林省農業科學院動物生物技術研究所飼養。

1.2 主要試劑與儀器 蛋白裂解液購自索萊寶生物公司；Western 相關儀器以及試劑均為實驗室之前保存；細胞培養皿來自corning 公司；細胞分化誘導劑（胰島素、地塞米松）、PBS 緩沖液、細胞分離試劑（胰蛋白酶、膠原酶）等均購自Sigma 公司；RNA 提取試劑TRIzol購自Invitrogen 公司；PCR 預混酶購自康為世紀生物公司；反轉錄試劑盒、DL2000 Maker 購自TaKaRa 生物有限公司；PCR 引物及測序服務由蘇州金唯智生物科技有限公司提供；LightCycler 480 SYBR Green I Master由羅氏（中國）公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 候選基因選擇 利用NCBI 網站（www.ncbi.nlm.nih.gov）選擇GEO Data Sets 項目，輸入與脂肪細胞相關的關鍵詞，尋找與脂代謝相關的公共測序數據3 組，分別為GSE97241、GSE90580、GSE51905。利用網站公布測序數據自帶的分析程序GEO2R 截取前250 個差異表達基因，然后將3 組測序數據合并，使用Venn 圖找到共有的差異表達基因，即富含半胱氨酸酸性分泌蛋白類似物1（Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine Like 1，SPARCL1）。

1.3.2 提取8 只綿羊各組織總RNA 利用液氮將目的組織研磨成粉末，按照TRIzol 說明書指示方法提取各組織總RNA。紫外分光光度計檢測RNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。合格后利用TaKaRa 反轉錄酶體外合成cDNA，反應體系：Total RNA 500 ng，5×Master Mix 2 μL，RNase Free ddH2O 補充到 10 μL。反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，12℃保存。雙蒸水將cDNA 稀釋10 倍，用于實時熒光定量PCR 檢測。

1.3.3 分離綿羊前體脂肪細胞并誘導 屠宰2 月齡綿羊，無菌取腹股溝處白色脂肪組織，剔除筋膜及血塊，將組織剪成1 mm3方塊。膠原酶II 消化組織1 h，期間每5 min 混勻1 次，消化后液體經200 目以及400 目濾網，過濾出未消化的組織及雜細胞。1 500 r/min 離心15 min 棄上清，完全培養液重懸細胞并接種到60 mm培養皿中。細胞6 h 貼壁，12 h 換液，除掉雜細胞及未貼壁細胞。每48 h 換液，待細胞長滿培養皿，胰蛋白酶消化細胞，傳代培養。第3 代細胞進行體外誘導，胰島素、地塞米松以及IBMX 混合培養液作為誘導I 液誘導細胞，48 h 換誘導II 液（含胰島素的完全培養基），48 h 后換完全培養基。繼續培養直到顯微鏡下看到細胞出現脂滴，油紅O 染色驗證成熟的脂肪細胞。選擇細胞分化前及分化后2 個時期提取RNA 和蛋白，用于后續實驗。

1.3.4 引物設計及驗證 根據Genbank 中綿羊SPARCL1基因mRNA 序列（XM_004009982.3）以及內參基因GAPDH序列（NM_001190390.1）利用Primer 5 軟件設計實時熒光定量RCR 引物序列，引物具體信息見表1。普通PCR 方法檢測引物特異性。PCR 反應體系20 μL：預混酶10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模板 1 μL、ddH2O 8 μL；擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸溫度8 s，35個循環，72℃延伸8 min，4℃保存。產物經瓊脂糖凝膠電泳實驗，條帶單一的PCR 引物可用于定量實驗。

表1 SPARCL1 基因引物序列

1.3.5 實時熒光定量PCR 和Western Blot 檢測 RTqPCR 體系為20 μL：Light Cycler 480 SYBR Green I Master（2×）10 μL、ddH2O 8 μL、cDNA 1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL。反應程序：95℃ 5 min，95℃10 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s，共40個循環，95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，40 ℃ 10 s，每組 實驗重復3 次。Roche Lightcycler 480 軟件進行數據分析。Western Blot 檢測，裂解液裂解細胞30 min 獲得細胞蛋白，100℃沸水煮蛋白10 min，使其變性。制備分離膠與濃縮膠，待膠凝固后，將蛋白注入膠孔20 μL，電壓80 V，20 min，待蛋白跑到分離膠后，換電壓120 V，40 min，跑膠結束后進行轉膜。將分離膠上蛋白轉移到PVDF 膜上，200 mA 條件下轉膜60 min，TBST 洗5 min 后，用含有5% 脫脂奶粉的封閉液封閉膜2 h。TBST 洗3 次，每次5 min，一抗4℃搖過夜。第二天TBST 洗3 次，每次5 min，二抗室溫搖2 h，TBST 洗3 次，每次5 min，顯色液孵育1 min 后照相。

1.4 統計分析 每組實驗重復3 次，數據以“平均值±標準差”表示，采用GraphPad Prism 軟件作圖，利用SPSS 17.0 對數據進行t檢驗或單因素方差分析，顯著性水平定為P＜0.05，極顯著水平定為P＜0.01。

2 結果

2.1SPARCL1基因在綿羊各組織的表達差異 如圖1所示，SPARCL1基因在綿羊各組織的表達譜中，在綿羊脂肪組織中表達最高。

圖1 SPARCL1 基因在綿羊各組織表達譜

2.2SPARCL1基因在不同綿羊個體脂肪組織中的表達差異 如圖2 所示，SPARCL1基因在7 號個體綿羊脂肪組織表達量最高。經實驗室前期測定，7 號綿羊的耗料增重比最高（表2）。

圖2 SPARCL1 基因在不同綿羊脂肪組織中表達趨勢

表2 不同個體綿羊耗料增重比

2.3 體外培養脂肪細胞并誘導 如圖3 所示，成熟脂肪細胞內脂滴能夠被染成紅色以鑒定為脂肪細胞。脂肪細胞通常會聚集在一起，脂滴形成串珠形態。

圖3 油紅O 染脂肪細胞圖

2.4SPARCL1基因在綿羊脂肪細胞分化過程的表達差異如圖4 所示，細胞分化后SPARCL1基因相對表達較細胞分化前顯著升高（P≤0.05）。Western Blot 蛋白免疫印跡結果也具有相同趨勢（圖5）。

圖4 SPARCL1 基因脂肪細胞分化前后期表達趨勢

圖5 SPARCL1 蛋白在脂肪細胞分化前后期表達趨勢

3 討 論

本研究通過生物信息學方法尋找到綿羊脂代謝相關新的調控基因SPARCL1。該候選基因源自小鼠脂肪細胞測序數據，因此需要在綿羊個體進行驗證。實驗發現SPARCL1基因不僅在綿羊脂肪組織中高表達，且在不同綿羊個體脂肪組織中的表達也存在差異。SPARCL1基因在飼料利用率最高的綿羊個體脂肪組織中表達最高。這也間接說明SPARCL1基因可能對于飼料利用率或者脂肪增殖方面具有影響。脂肪細胞分化前期與后期2 個階段，SPARCL1基因在分子水平以及蛋白水平均出現顯著變化且趨勢相同，說明SPARCL1基因可能參與脂肪細胞分化，其具體機制值得研究。

SPARCL1 屬于SPARC 家族成員，為具有分泌功能的基質糖蛋白。SPARCL1 是介導細胞基質相互作用的黏附分子，參與機體多項生理過程，如細胞黏附、增殖、分化、遷移、成熟等[2]。SPARCL1基因在動物胚胎期以及組織受傷重塑時高表達，惡性腫瘤組織中SPARCL1基因表達顯著低于正常組織。有研究發現，轉染外源過表達SPARCL1質粒后，腫瘤細胞遷移、侵襲、生長受到抑制[3]。目前SPARCL1基因在癌癥預防、治療等方面研究較多，研究也表明SPARCL1基因是與腫瘤相關的重要因子[4-9]，具有腫瘤抑制作用[10]。最近有研究發現，SPARCL1基因能夠抑制小鼠前體脂肪細胞分化，參與脂代謝過程[11]，這也堅定了本課題組對于SPARCL1基因在綿羊脂代謝方面進行深入研究的信心。

4 結 論

本實驗利用NCBI 網站公共測序數據GSE97241、GSE90580、GSE51905，取3 組共有差異表達基因SPARCL1作為綿羊脂代謝相關候選基因，結果顯示SPARCL1基因在綿羊脂肪組織中高表達，同時在飼料轉化率高的綿羊個體脂肪組織中顯著表達。分子以及蛋白水平均檢測出SPARCL1基因在脂肪細胞分化前后出現差異表達。