杜滇豬和杜藏豬SLA-DQB、SLA-DRB 基因第二外顯子雜交優勢分析

孫海潮，肖明霞，劉韶娜，張 斌，趙彥光*，趙素梅*

（1.云南農業大學動物科學技術學院，云南昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫科學院，云南昆明 650224）

雜交后代杜藏豬（杜洛克豬♂×迪慶藏豬♀）是以杜洛克豬為父本、迪慶藏豬為母本雜交而成，雜交杜滇豬（杜洛克豬♂×滇南小耳豬♀）是以杜洛克豬為父本、滇南小耳豬為母本雜交而成。迪慶藏豬、滇南小耳豬是云南省優良的地方品種，其中迪慶藏豬為我國特有的高原型地方豬品種，主要分布在迪慶高寒地區，抗病力和抗逆性強，耐寒、耐粗飼[8-9]，滇南小耳豬作為小型豬具有體型小、早熟、遺傳穩定、抗逆性強等獨特的基因資源，是理想實驗動物模型。杜洛克是世界著名瘦肉型豬種之一，其生長快、瘦肉多、適應性強，能耐低溫，但對高溫的耐力較差。本研究采用PCR-RFLP 法對杜滇豬、杜藏豬的SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子進行研究、檢測并分析其多態性，與迪慶藏豬、滇南小耳豬、杜洛克豬的SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子的雜合度和多態信息含量等進行比較，分析其雜交后的變化，探究雜交豬SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子多態性的雜交優勢。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗豬群：迪慶藏豬47 頭、滇南小耳豬53 頭、杜洛克豬56 頭、杜藏豬（杜洛克豬♂×迪慶藏豬♀）30 頭、杜滇豬（杜洛克豬♂×滇南小耳豬♀）33 頭，均來自云南省畜牧獸醫科學院實驗豬場，每頭豬剪取1 g 左右豬耳組織，保存于裝有75%乙醇的1.5 mL Eppendorf 管中，-20℃凍存備用。

1.2 主要試劑及儀器 限制性內切酶RsaI、限制性內切酶HaeIII（購自北京擎科生物科技有限公司）；培清JS-780 型凝膠成像儀；PCR 擴增儀、電泳儀（購自美國BIO-RAD 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA 提取 參照DNA 提取試劑盒說明書進行提取。

1.3.2 引物設計及合成 檢索基因數據庫找到相關基因片段序列，查閱文獻，根據Shia[10]等報道對SLA-DQB基因（Gene ID：100037921）和SLA-DRB基因（Gene ID：100153386）第二外顯子的引物序列進行設計，由北京擎科生物科技有限公司合成，SLA-DQB、SLADRB擴增片段大小分別為273、245 bp，引物序列設計見表1。

表1 SLA-DQB 和SLA-DRB 基因擴增引物

1.3.3 PCR 擴增 根據參考文獻和實驗得出SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子PCR 擴增最佳反應條件和體系。擴增體系（25 μL）為：2×Taq PCR Mix（10 mmol/L）12.5 μL、上游引物（100 mol/L）1 μL、下游引物（100 mol/L）1 μL、DNA 模板（10×）2 μL、ddH2O 8.5 μL。SLA-DQB基因PCR 擴增反應條件為：94℃預變性5 min、94℃變性30 s、61.9℃退火45 s、72℃延伸45 s、共30 個循環，最后72 ℃延伸8 min；SLADRB基因PCR 擴增反應條件為：98℃預變性2 min、98℃變性10 s、59℃退火30 s、72℃延伸20 s、共30 個循環，最后72℃延伸1 min。取PCR 擴增產物（5 μL）進行電泳檢測，在凝膠成像系統觀察結果并拍照，與預期的片段大小相同則擴增成功。

1.3.4 DNA 序列測定 待測樣本送至北京擎科生物有限公司昆明分公司進行檢測。

目前，許多建筑工程在空間設計過程中都注重節能策略的應用。進一步完善和改進節能策略的應用理念和方式，可以為建筑空間設計工作的發展提供有利的條件。但目前，在很多建筑施工過程中仍然采用普適的空間設計理念，忽視了節能策略的應用，為了提高建筑空間設計的質量，實施節能戰略，建筑工程不僅要認識和理解節能戰略與空間設計的關系，而且要注意要點和原則。只有這樣，才能有效地提高建筑空間的設計水平，有助于城市化建設和發展。

1.3.5 PCR-RFLP 檢測 用限制性內切酶HaeIII、RsaI分別對實驗豬群SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子PCR 擴增產物進行酶切，37℃過夜完成酶切反應。酶切體系（20 μL）為：HaeIII 酶（1000 0 U/mL）0.2 μL/RsaI 酶（1000 0 U/mL）0.2 μL、PCR 擴增產物10 μL、Cut Smart Buffer（10×）1 μL、ddH2O 8.8 μL。最后用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察酶切結果并判斷基因型。

1.3.6 統計分析 運用DNA Star 軟件對DNA 序列進行比較分析，用Primer 5.0 軟件進行酶切位點分析，根據HaeIII、RsaI 內切酶的識別位點，對SLA-DQB基因和SLA-DRB基因第二外顯子的酶切帶型圖譜進行分析，確定各個泳道的RFLP 帶型，判斷基因型并標記。通過Excel 計算限制性酶切位點的等位基因頻率、雜合度（He）及多態信息含量（PIC）。

2 結果

2.1 PCR 擴增結果 用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗豬SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子PCR 擴增產物，結果如圖1、圖2，長度分別為273、245 bp，符合預期的擴增片段長度，可進行RFLP 分析。

圖1 SLA-DQB 基因第二外顯子的PCR 擴增結果

圖2 SLA-DRB 基因第二外顯子的PCR 擴增結果

2.2 DNA 序列檢測結果及SNP 位點識別 目的片段測序結果顯示，實驗豬群SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子的片段大小分別為273 bp 和245 bp，與本研究結果相符，與有關文獻報道一致[11]。實驗豬群SLADQB基因第二外顯子擴增序列共5 個SNP 位點：5'端第二外顯子40 bp 處存在堿基T 突變為堿基G（T40G），5'端第二外顯子84、189 bp 處存在堿基G 突變為堿基A（G84A、G189A），5'端第二外顯子171 bp 處存在堿基A 突變為堿基G（A171G），5'端第二外顯子221 bp處存在堿基C 突變為堿基A（C221A）（圖3）。

圖3 SLA-DQB 基因第二外顯子SNP 位點序列比對

實驗豬群SLA-DRB基因第二外顯子擴增序列有4個SNP 位點：5'端第二外顯子92 bp 處存在堿基A 突變為堿基G（A92G）；5'端第二外顯子112 bp 處存在堿基A 突變為堿基T（A112T）；5'端第二外顯子142 bp處存在堿基A 突變為堿基T（A142T）；5'端第二外顯子180 bp 處存在堿基G 突變為堿基T（G180T）（圖4）。

圖4 SLA-DRB 基因第二外顯子的序列SNP 位點比對

2.3 PCR-RFLP 分型結果及多態性分析結果 實驗豬個體用PCR-RFLP 方法檢測分型并計算出基因型頻率和等位基因頻率，將條帶屢次不清晰沒有結果的樣本舍棄，得到有效樣本總數。杜洛克豬、迪慶藏豬、滇南小耳豬、杜藏豬、杜滇豬SLA-DQB基因第二外顯子的有效樣本個數分別為56、47、53、30、33 個，SLA-DRB基因第二外顯子的有效樣本個數分別為53、44、49、29、29 個。

2.3.1SLA-DQB基因第二外顯子PCR-RFLP 分型結果及多態性分析結果HaeIII 內切酶識別位點為5'...GG↓CC...3'，經DNAStar 軟件分 析，SLA-DQB基因第二外顯子含有4 個HaeIII 酶切位點，理論上，酶切帶型為84 bp/83 bp/23bp/29 bp/54 bp，記為“B 等位基因”；但實際研究中出現4 條酶切帶型，與理論上不同的3 條分別為：167 bp/52 bp/54 bp；167 bp/4 bp/102 bp；40 bp/127 bp/4 bp/102 bp，分別記為A、C、E 等位基因；與測序結果相符合，說明基因發生突變，酶切識別位點位置發生改變。5 個豬種共檢測得到A、B、C、E 4 個等位基因，AA、AB、AC、BB、BC、CC、EE 7 種基因型。杜洛克豬共檢測到AA、AB、BB、BC、CC 5 種基因型，A、B、C 3 個等位基因。迪慶藏豬共檢測到AA、BB、BC、CC、EE 5 種，A、B、C、E 4個等位基因，是檢測的所有豬種中唯一擁有E 等位基因、EE 基因型的豬種。滇南小耳豬共檢測到AB、BC、CC 3 種基因型，A、B、C 3 個等位基因。3 個豬種的優勢基因都是C 等位基因，基因頻率分別為0.661、0.511、0.774，優勢基因型都為CC 型，HaeIII 酶切結果見圖5。

圖5 父本、母本豬SLA-DQB 基因第二外顯子Hae III 酶切結果

杜藏豬共檢測到AB、AC、BB、BC、CC 5 種基因型，A、B、C 3 個等位基因，且優勢基因與其雙親一致為C等位基因，基因頻率為0.517，優勢基因型也都為CC 型。杜滇豬共檢測到AB、AC、BB、BC、CC 5 種基因型，A、B、C 3 個等位基因。杜滇豬與其雙親不同的是，優勢基因為B 等位基因，基因頻率為0.470，優勢基因型也與雙親不同，為BC 型。酶切結果見圖6。

圖6 雜交后代豬SLA-DQB 基因第二外顯子Hae III 酶切結果

SLA-DQB基因第二外顯子在HaeIII-RFLP 位點上，被檢測的豬群均表現多態性。如表2 所示，迪慶藏豬SLA-DQB基因第二外顯子PIC 為0.555，呈高度多態（PIC＞0.5），在5 個豬種中最高，杜洛克豬和滇南小耳豬分別為0.419、0.298，呈中度多態（0.25≤PIC≤0.5）；杜藏豬的PIC 為0.420，呈中度多態（0.25≤PIC≤0.5）；杜滇豬的PIC 為0.523，呈高度多態（PIC＞0.5）。迪慶藏豬的He 為0.619，呈高度雜合（He＞0.5），在5 個豬種中最高；杜洛克豬和滇南小耳豬的He 分別為0.487、0.354，都呈中度雜合（0.25≤He≤0.5）；杜藏豬和杜滇豬的He 分別為0.529、0.606，都呈高度雜合（He＞0.5）。

表2 SLA-DQB 基因第二外顯子等位基因頻率和基因型頻率

2.3.2SLA-DRB基因第二外顯子PCR-RFLP 分型結果及多態性分析結果RsaI 內切酶識別位點為5'...GT↓AC...3'；經DNA Star 軟件分析，理論上，RsaI酶含有2 個酶切位點，酶切后產生一條酶切帶型為：141 bp/93 bp/11 bp，記為A 等位基因；實際研究中出現4 條酶切帶型，不同于理論上的3 條帶型分別為：111 bp/69 bp/54 bp/11 bp；93 bp/48 bp/39 bp/54 bp/11 bp；180 bp/54 bp/11 bp；分別記為B、C、D 等位基因；與測序結果相符合，說明基因發生突變。用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，5 個豬種共檢測得到A、B、C、D 4 個等位基因，AA、AB、AC、AD、BB、BD、CC、DD 8 種基因型。

杜洛克豬共檢測到AA、AB、CC 3 種基因型、A、B、C 3 個等位基因；迪慶藏豬共檢測到AA、AB、AD、BB、CC、DD 6 種基因型，A、B、C、D 4 個等位基因；滇南小耳豬共檢測到AA、AB、AC、AD、BB 5 種基因型，A、B、C、D 3 個等位基因。3 個豬種的優勢基因都是A 等位基因，基因頻率分別為0.943、0.670、0.633，杜洛克豬和迪慶藏豬的優勢基因型都為AA 型，滇南小耳豬為AB 型，RsaI 酶切結果見圖7。

圖7 父本、母本豬SLA-DRB 基因第二外顯子Rsa I 酶切結果

杜藏豬共檢測到AB、AB、AC、AD、BB、BD、CC、DD 8 種基因型，A、B、C、D 4 個等位基因。杜藏豬的優勢基因與雙親一致為A 等位基因，基因頻率為0.448，優勢基因型也與雙親一致為AA 型，但杜藏豬出現了雙親都沒有的AC、BD 基因型。杜滇豬共檢測到AA、AB、BB、BD、DD 5 種基因型，A、B、D 3 個等位基因，杜滇豬與父本杜洛克豬一致，沒有C 等位基因，優勢基因為B 等位基因，基因頻率為0.483，優勢基因型為BB 型。RsaI 酶切結果見圖8。

圖8 雜交后代豬SLA-DRB 基因第二外顯子Rsa I 酶切結果

SLA-DRB基因第二外顯子在RsaI-RFLP 位點上，被檢測的豬群均表現多態性。由表6 可知，杜洛克豬SLA-DRB基因第二外顯子PIC 為0.101 1，呈低度多態（PIC＜0.25），在5 個豬種中最低；迪慶藏豬和滇南小耳豬的PIC 分別為0.456、0.426，都呈中度多態（0.25≤PIC≤0.5）。杜藏豬的PIC 為0.602，呈高度多態（PIC＞0.5），在5 個豬種中最高；杜滇豬中為0.533，呈高度多態（PIC＞0.5）。杜洛克豬的He 為0.106，呈低度雜合（He＜0.25），在5 個豬種中最低；迪慶藏豬和滇南小耳豬He 分別為0.503、0.503，都呈高度雜合（He＞0.5）。杜藏豬的He 為0.602，呈高度雜合（He＞0.5），在5 個豬種中最高；杜滇豬的He 為0.612，呈高度雜合（He＞0.5）。各遺傳多態性參數計算結果見表3。

3 討 論

豬品種間雜交會使核苷酸序列變異，從而引起基因型的變異。喻傳洲[12]研究雜種優勢的表現規律時提出，雜交親本的遺傳差異程度與雜種優勢率呈正向關聯，即親本差異越大，雜種優勢越大，且雜種優勢與雜種群內的基因雜合程度有關。并且有關研究表明，SLA-DQB、SLA-DRB基因的高雜合度和高度多態信息含量有利于機體對多樣性的外來抗原選擇，提高其抗病力[13]。本研究結果顯示：杜藏豬SLA-DQB基因第二外顯子含5 個基因型，出現雙親沒有的AC 型；杜滇豬SLA-DQB基因第二外顯子含5 個基因型，出現雙親沒有的AC 型。杜藏豬的PIC 和He 高于父本杜洛克豬但略低于母本迪慶藏豬，而杜滇豬的PIC 和He 都高于雙親，因此杜滇豬SLA-DQB基因第二外顯子的多態性表現出良好的雜交優勢。談永松等[14]研究表明杜洛克豬SLA-DRB第二外顯子呈低度多態，出現AA、AB 型，變異程度較低，品種純合度高。本研究結果表明，杜藏豬SLA-DRB第二外顯子含8 個基因型，出現了雙親都沒有的AC、BD 基因型；杜滇豬SLA-DRB第二外顯子含5 個基因型，出現雙親都沒有的BD、DD 基因型；其他豬種的優勢等位基因都為A 等位基因，只有杜滇豬為B 等位基因。杜滇豬和杜藏豬SLA-DRB基因第二外顯子的PIC 和He 都高于雙親，表現出了良好的雜交優勢。

田大成等[15]提出，在基因序列中只要插入或缺失某一個關鍵核苷酸，或有另一個核苷酸替代原有的核苷酸，會形成新的氨基酸，其性狀就會發生變異，或者影響到周圍其他核苷酸的變異。齊芬芳[16]等篩選出與香豬抗病性狀相關的重要候選基因23 個，其中10 個基因編碼膜上蛋白，與CD14 分子、MHCII 類分子以及T 細胞誘導等相關，在免疫相關代謝通路中起著極其重要的作用，并提出基因組水平的結構變異影響基因的功能，以致影響個體表型性狀。本研究中，杜藏豬SLADQB基因第二外顯子出現了父本杜洛克豬的4 個SNP位點（G84A、A171G、G189A、C221A），但沒有發現母本的T40G 突變位點；杜滇豬SLA-DQB基因第二外顯子的SNP 位點與雙親相比較，未出現A171G 這1個SNP 位點；杜藏豬、杜滇豬SLA-DQB基因第二外顯子的DNA 序列檢測及SNP 位點識別結果，表明是核苷酸突變。杜藏豬SLA-DRB第二外顯子出現了父本杜洛克豬的2 個SNP 位點（A112T、A142T）、母本迪慶藏豬的2 個SNP 位點（A92G、G180T）；杜滇豬SLA-DRB第二外顯子出現了父本杜洛克豬的2 個SNP位點（A112T、A142T），母本滇南小耳豬的1 個SNP位點（G180T），但出現了雙親沒有的BD、DD 基因型。杜藏豬、杜滇豬SLA-DRB基因第二外顯子的DNA 序列檢測及SNP 位點識別結果，表明雜交使得杜藏豬、杜滇豬核苷酸序列發生改變，從而引起基因型變異。母童等[17]對煙臺黑豬SLA-DQB基因第二外顯子多態性及其與仔豬腹瀉進行了關聯分析，王國梅等[18]對八眉豬也進行了相關研究，都表明仔豬腹瀉的易感性和抗性與不同基因型有著必然的聯系。本研究中SNP 位點突變是否對雜交仔豬腹瀉的易感性和抗性產生影響、有何具體關系還需進一步研究。

吳晶等[19]提出迪慶藏豬由于長期處于自繁自養的狀態，近交現象比較嚴重，農（牧）民飼養管理技術欠缺指導等導致優良個體數、群體數量和規模都呈減少狀態。本研究中迪慶藏豬SLA-DQB基因第二外顯子出現其他4 種豬沒有的EE 基因型，可能與品種培育歷史和高寒的地理環境有關。迪慶藏豬SLA-DQB基因第二外顯子PIC 和He 在5 個豬種中最高；SLA-DRB第二外顯子也呈高度雜合、高度多態，劉韶娜等[20]研究發現杜藏豬（杜洛克豬♂×迪慶藏豬♀）的生長性能及屠宰性能較雜交前均有提高，表明應用國外優良的瘦肉型豬與迪慶藏豬雜交不僅可以提高經濟效益，還能利用雜交優勢增強雜交豬對環境的適應性、提高抗病能力，也能一定程度上保護迪慶藏豬這一珍貴的地方豬種資源。由杜藏豬、杜滇豬SLA-DQB和SLA-DRB基因第二外顯子表現出良好的雜交優勢也提示，有必要進一步研究雜交豬種基于SLA基因氨基酸變異的功能多肽與豬抗病性和異種移植之間的關系，從而更好地利用雜交豬種的雜交優勢并為抗病育種的實際工作提供理論指導。