FSHR 基因多態性及其與隴東絨山羊產雙羔關聯性分析

周步峰，石福岳，張建軍，何茂昌，王耀榮，謝文章

（1.甘肅省畜牧獸醫研究所，甘肅平涼 744000；2.華池縣畜牧獸醫站，甘肅華池 745600；3.環縣畜禽改良站，甘肅環縣 745700）

隴東絨山羊是科技工作者深入一線經多年選育、提純、復壯形成的一個絨肉兼用型山羊品種。該品種能很好地適應隴東地區干旱、半干旱的自然生態環境，且因其遺傳性能穩定、產絨量高、羊絨品質優良和肉質細嫩等優點[1]，深受本地區養殖戶的青睞，已成為隴東及周邊地區羊產業的主導品種。然而，隴東絨山羊為季節性發情，產仔數少，從而制約了羊產業化、規模化發展，提高其繁殖效率也就成為研究熱點。雖有部分產雙羔的群體，但是其遺傳機制不清楚。有研究結果表明，動物的繁殖性狀與FSHR基因存在重要的聯系。龍威海等[2]采用熒光定量PCR 技術分析了南江黃羊不同組織中FSHR基因的表達量，結果表明，FSHR基因在母羊子宮中的表達水平顯著高于其他組織，在公羊睪丸組織中的表達量顯著高于下丘腦和垂體。王德迪[3]等研究了綿羊FSHR基因3'UTR 多態性，發現一個新的SNP 位點，且等位基因頻率在高繁殖力品種（湖羊）和低繁殖力品種（巴什拜羊）間存在顯著差異，因此推測FSHR基因的多態性可能與綿羊高繁殖力有關。本研究以隴東絨山羊雙羔母羊及所產F1代為實驗材料，對隴東絨山羊FSHR基因第10 外顯子進行多態性檢測，旨在尋找與產羔數相關的SNPs 位點，探討該基因作為候選基因標記隴東絨山羊雙羔性狀的可行性，以便為隴東絨山羊雙羔品系的選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取來自華池縣和環縣的隴東絨山羊160 只，其中單羔和多羔母羊各55 只、雙羔母羊的F1代母羊50 只；具有產羔記錄的遼寧絨山羊母羊50 只。

1.2 血液采集及DNA 提取 頸靜脈采集血液5 mL，于EDTA 抗凝管中-20℃保存備用。使用OMEGA 全血DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，并于-20℃冰箱冷凍保存。

1.3 引物設計及PCR 擴增 參考山羊FSHR基因序列（登錄號：KJ817181），使用引物設計軟件Primer Premier 5 設計3 對引物（表1）。PCR 反應體系為20 μL，包 括：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，DNA 模 板1 μL（100 ng），上、下游引物各1 μL（10 pmol/L），ddH2O 7 μL。PCR 擴增反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，退火30 s，72℃延伸1 min，30 個循環；最后72℃延伸10 min。產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格的PCR 產物用于SSCP 檢測。

表1 FSHR 基因引物序列信息

1.4 PCR-SSCP 檢測及測序 取2 μL PCR 產物和8 μL 變性緩沖液（9.6 mL 甲酰胺、10 mmol/L EDTA 200 μL，0.025% 溴酚藍、0.025% 二甲苯氰FF），混勻，98℃變性10 min，然后迅速放入冰浴中10 min。用10%的聚丙烯酰胺凝膠（29:1）140 V 電泳12 h，銀染后判定基因型。選取不同基因型的PCR 產物送至北京三博遠志生物技術公司進行測序。

1.5 數據統計 應用POPGEN 1.32 計算基因頻率、有效等位基因數（Ne）、表觀雜合度（Ho）、期望雜合度（He），用PIC 分析軟件計算多態信息含量（PIC），并進行χ2檢驗和加性顯性模型分析。采用SPSS18.0 軟件的GLM 程序分析基因型與絨山羊產羔數（TNB）的相關性，采用LSD 法進行多重比較，不同基因型對應的TNB 均用“最小二乘均數± 標準誤（LSM±SE）”來表示。

2 結果

2.1 隴東絨山羊血液DNA 提取結果 采用試劑盒法提取血液DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后結果見圖1。如圖1 所示，所提取的DNA 濃度較高，無雜帶及拖尾現象，表明提取的DNA 純度較高，可以用于后續實驗。

圖1 血液DNA 提取結果

2.2FSHR基因PCR 擴增產物檢測結果 由圖2 可知，各引物擴增產物與預期產物大小一致，且特異性較好，可以用于下一步SSCP 分析。

圖2 FSHR 基因擴增結果

2.3FSHR基因SSCP 檢測結果 分別對3 對引物的PCR 擴增產物進行SSCP 分析，結果只有P2 引物擴增產物檢測到4 種不同帶型，這4 種帶型分別定義為AA、AB、AC 型和BB 型，其中AA 型為野生型，其余3 種基因型為突變型。將這4 種不同基因型PCR 產物送生物公司測序。通過DNASTAR 軟件對測序結果進行分析和比對，結果在1 542 bp 處和1 595 bp 處發生堿基突變（圖4）。其中1 542 bp 處堿基突變（G/T）未引起氨基酸改變，為同義突變，而1 595 bp 處堿基突變（T/G）為錯義突變，導致所編碼氨基酸由甲硫氨酸（Met）變為精氨酸（Arg）。

圖3 P2 引物擴增產物的SSCP 檢測電泳圖

圖4 P2 引物擴增產物的SSCP 測序結果

2.4 遺傳學統計分析

2.4.1 基因型頻率與基因頻率 由表2 可知，隴東絨山羊雙羔母羊群體及其F1代的優勢基因型為突變型AB，BB 型次之，等位基因B 的頻率最高，因此可初步確定優勢等位基因為B。而隴東絨山羊單羔母羊群體和遼寧絨山羊群體的優勢基因型均為AA 型，等位基因A 的頻率最高。4 個群體中的AC 型頻率均最低。

表2 FSHR 基因P2 引物基因型頻率和等位基因頻率

2.4.2 多態性群體遺傳結構分析 對FSHR基因多態位點雜合度、有效等位基因數、多態信息含量等多態性參數及Hardy-Weinberg（H-W）平衡進行分析，結果見表3。由表3 可知，隴東絨山羊雙羔群體及其F1代群體的SNPs 位點雜合度較高，而遼寧絨山羊群體和隴東絨山羊單羔群體的純合度較高。有效等位基因數在4 個群體間總體趨勢一致，與實際檢測到的基因數基本相符。隴東絨山羊雙羔群體及其F1代群體的多態信息含量均表現為高度多態（PIC＞0.50），單羔群體和遼寧絨山羊群體的PIC 表現為中度多態（0.25＜PIC＜0.50）。經Hardy-Weinberg 平衡（χ2）檢驗，隴東絨山羊雙羔母羊群體達到了顯著水平，即FSHR基因該位點偏離了Hardy-Weinberg 平衡狀態；而F1代群體、單羔群體和遼寧絨山羊的χ2檢驗值均未達到顯著水平，即群體FSHR基因該位點處于Hardy-Weinberg 平衡狀態。

表3 FSHR 基因多態位點遺傳變異參數

2.5FSHR基因SNPS 與隴東絨山羊繁殖性能相關性分析 隴東絨山羊及遼寧絨山羊FSHR基因第10 外顯子不同基因型母羊產羔數的最小二乘平均數和標準誤分析結果見表4。由表4 可見，隴東絨山羊AB 型和BB 型個體的產羔數高于AA 型和AC 型的，且差異顯著；AA 型與AC 型間、AB 型與BB 型間的產羔數則無顯著差異。遼寧絨山羊各基因型個體的產羔數無顯著差異。

表4 FSHR 基因不同基因型個體產羔數最小二乘平均值及標準誤

3 討 論

3.1FSHR基因外顯子10 多態性分析FSHR在人和雌性哺乳動物生殖活動中具有重要作用，其基因含有10個外顯子和9 個內含子，主要在第10 外顯子進行跨膜域和胞內域的編碼[3]，由此可見，第10 外顯子的功能是非常重要的。有研究結果顯示，FSHR基因多態性可能與動物產仔數等性狀有關聯。關于動物FSHR基因多態性的研究多集中在5' 非翻譯區、外顯子1 和外顯子10。許瑤[5]等在香豬FSHR基因第10 外顯子發現3 個SNPs 位點，即rs322800083（C/T）、rs322115220（T/C）和novel 1（G/A），其中rs322800083（C/T）位點突變導致其編碼氨基酸由蘇氨酸（Thr）變為異亮氨酸（Ile）。吳井生[6]等在小梅山母豬FSHR基因外顯子10 中檢測到C1166T 和T1491C 位點。楊孔[7]等研究發現FSHR基因第1 外顯子和第4 外顯子在藏雞和羅曼雞種群間分別存在SNP 位點，Exon1 處表現為EE 和EF 2 種基因型，Exon 4 表現為3 種基因型（GH、GI和HI），且會引起氨基酸突變。陳祥[8]等在貴州黑山羊和黔北麻羊FSHR基因第1 和第10 外顯子各檢測到1 個多態位點，即C126T 和C1246A，表現為3 種基因型。本研究在隴東絨山羊和遼寧絨山羊FSHR基因第10 外顯子處檢測到2 個SNPs 位點：T1595G 和G1542T，其中1 595 位點的堿基突變導致氨基酸由甲硫氨酸（Met）變為精氨酸（Arg）。表現為4 種基因型（AA、AB、BB 和AC），其中在隴東絨山羊雙羔母羊群體及其F1代群體中，AB 型和BB 型基因型頻率均高于AA 型和AC 型基因型頻率，隴東絨山羊單羔母羊群體和遼寧絨山羊群體中，AA 基因型頻率最高，AB 型次之。說明該基因突變位點可能是影響隴東絨山羊產羔數性狀的一個重要候選基因并可以遺傳給其后代。未檢測出BC 基因型和CC 基因型，可能與檢測樣本量偏少有關。這一結果與姜懷志[9]、陳祥[8]等的研究結果類似。

3.2FSHR基因多態性的遺傳結構分析 基因雜合度又稱基因多樣度，是度量群體遺傳變異程度大小的一個參數。本實驗中隴東絨山羊雙羔母羊群體及其F1代群體基因雜合度高于單羔母羊群體，說明雙羔群體變異程度高于單羔群體，即遺傳多樣性高于單羔群體。有效等位基因數反映了等位基因間的相互影響，等位基因在群體中分布得越均勻，則有效等位基因數值越接近實際檢測到的等位基因數。同時，有效等位基因數值較大的品種，其期望雜合度和多態信息含量值也相應較高[10]。對一個群體而言，多態信息含量高、有效等位基因數目多、雜合度大，則該位點的遺傳變異性就高，說明其有較大的選擇潛力。本研究中3 個群體的有效等位基因數值相近，與實際檢測到的等位基因數目基本一致，但隴東絨山羊雙羔母羊及其F1代群體的有效等位基因數和多態信息含量相對高于其他2 個群體，說明其遺傳變異性較高，有較大的人工選擇潛力。遼寧絨山羊多態信息含量和有效等位基因數較低，說明該基因位點在遺傳過程中較保守，趨于穩定。經Hardy-Weinberg 平衡（χ2）檢驗，隴東絨山羊雙羔母羊群體及其F1代群體達到了顯著水平，即FSHR基因該多態位點偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態，說明其可能受漂變、選擇、引種等因素的影響，可以將其作為新品系培育過程中的一個分子標記位點；而單羔群體和遼寧絨山羊群體均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態，說明其遺傳較穩定，受人工選擇影響程度較小。

3.3FSHR基因不同基因型與產羔數的相關性 作為繁殖性能的候選基因之一，FSHR基因一直是遺傳學者研究的熱點。在FSHR基因多態性與繁殖性能相關性的研究中，對人、牛、豬和羊方面的研究較多。研究發現FSHR基因與一些人類生殖疾病相關，如卵巢功能早衰[11]、男性不育[12-13]、卵巢癌癥[14]等。雷雪芹[15]等在秦川牛和荷斯坦牛FSHR基因外顯子10 上檢測到T1506C 多態位點，且該突變在秦川牛雙胎和單胎中的突變率分別為60%和20%，而在荷斯坦牛雙胎和單胎中的突變率分別為31.25%和6.67%，提示該多態位點可能作為牛雙胎性狀的候選SNPs。研究表明，FSHR基因座位的遺傳特性與二花臉豬最高產活仔數顯著相關[16]，也可能與波爾山羊個體的超排潛力有關[17]。姜懷志[9]通過PCR-SSCP 檢測了遼寧絨山羊和薩能奶山羊雙羔和單羔母羊FSHR基因多態性，結果表明，遼寧絨山羊雙羔母羊中突變率為53.3%，而單產母羊中只有6.67%的突變率，薩能奶山羊雙羔母羊的突變率是單羔母羊的3 倍。表明FSHR基因第10 外顯子可以作為雙羔性能的標記基因，而且雙羔性狀與候選基因的多態性呈正相關。本研究通過分析隴東絨山羊FSHR不同基因型個體產羔數的最小二乘平均數間的差異，研究FSHR基因多態位點與產羔數的關聯性。結果表明，AB 型、BB 型個體的產羔數顯著高于AA 型和AC 型，且表現出BB 型＞AB型＞AA 型＞AC 型的趨勢，遼寧絨山羊各基因型個體間的產羔數差異雖不顯著，但仍表現為BB 型＞AB 型＞AA 型＞AC 型的趨勢，說明T1595G 突變位點可能是影響隴東絨山羊產雙羔的1 個SNP 位點。

4 結 論

本研究在隴東絨山羊和遼寧絨山羊FSHR基因第10 外顯子檢測到2 個SNPs 位點，其中1 個SNPs 可引起氨基酸改變。隴東絨山羊雙羔群體優勢基因型為AB型，優勢等位基因為B。經最小二乘法分析，不同基因型個體產羔數平均數由大到小依次為BB 型＞AB 型＞AA 型＞AC 型，提示FSHR基因T1595G 突變位點可能是影響隴東絨山羊產雙羔的一個重要候選SNPs 位點。