脂肪細胞去分化及其調控機制研究進展

凌德鳳，王力儀，單體中

（浙江大學動物分子營養學教育部重點實驗室，浙江大學飼料科學研究所，浙江杭州 310058）

脂肪發育、沉積和代謝與動物的生長、生產、肉品質及人類健康密切相關。脂肪組織主要由脂肪細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、組織細胞和間充質干細胞等組成[1]。在哺乳動物體內，脂肪組織按照沉積部位可以分為皮下脂肪、內臟脂肪和肌內脂肪；按照顏色、形態、結構和功能的不同可以分為白色脂肪組織、米色脂肪組織和棕色脂肪組織。一方面，脂肪沉積直接影響畜禽的肉品質[2]；另一方面，脂肪過度沉積與肥胖、糖尿病、心血管疾病、動脈粥樣硬化等疾病密切相關[3]。因此，研究脂肪發育和沉積的調控機制具有重要意義。

一直以來，人們普遍認為分化是一個單向過程，但也有研究發現成熟脂肪細胞可以在體外去分化，形成具有分裂和增殖能力的去分化脂肪（Mature Adipocyte-Derived Dedifferentiated Fat，DFAT）細 胞[4]，DFAT 細胞具有多向分化潛能，可以再分化形成脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、血管細胞和神經細胞等[5-10]。此外，Wang 等[11]研究發現，在妊娠末期和哺乳期，乳腺的脂肪細胞會發生脂質丟失變成前脂肪細胞樣細胞的形態；Bi 等[12]研究發現，成熟脂肪細胞中高表達Notch 信號可誘導成熟脂肪細胞發生去分化。因此，脂肪細胞的去分化既可以發生在體外也可以發生在動物體內。本文在闡述脂肪細胞去分化的基礎上，重點綜述了DFAT 細胞的分化潛能、脂肪細胞去分化的調控機制及其在豬上的相關研究進展，為通過調控脂肪細胞去分化進而改善動物胴體和肉品質、提高人類健康水平提供一定的理論依據。

1 成熟脂肪細胞的形成與去分化

成熟脂肪細胞是由起源于中胚層的間充質干細胞逐步分化形成，包括間充質干細胞定向分化為前體脂肪細胞，前體脂肪細胞再進一步分化為成熟脂肪細胞（圖1），其中有多種轉錄調控因子和信號通路參與，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proliferators Activate Receptors，PPARγ）、CCAAT/增強子結合蛋白（CCAAT/Enhancer Binding Proteins，C/EBPs）和信號傳導及轉錄激活蛋白1（Signal Transducer and Activator of Transcription-1，STAT1）等[13]。成熟脂肪細胞的去分化是單房圓形指環狀脂肪細胞逐漸丟失胞質中的脂質，變為成纖維細胞樣細胞形態的DFAT 細胞的過程，DFAT 細胞是具有自我更新和多向分化潛能的細胞[14-15]。目前體外和體內脂肪細胞的去分化均已被發現和證實。

圖1 成熟脂肪細胞形成與去分化

1.1 體外去分化 1986 年，Sugihara 等[4]首次利用天花板培養法獲得具有分裂和增殖能力的去分化細胞，天花板培養法是一種利用脂肪細胞的漂浮性，將充滿培養基的培養瓶倒置，使其附著于培養瓶底部的方法。Nobusue 等[16]從綠色熒光蛋白轉基因小鼠皮下脂肪組織中分離出沒有間質血管細胞且高度均勻的成熟脂肪細胞，利用天花培養法建立了DFAT 細胞系，同時證明獲得的DFAT 細胞在體外培養至少22 代后仍具有增殖和分化能力。由于傳統的天花板培養法需要消耗大量的試劑和細胞，宋子儀等[17]用普通培養皿加細胞載玻片的組合方式，使成熟脂肪細胞發生去分化，體外培養至第14 天基本都去分化為不含脂滴的成纖維細胞樣細胞，并證明成熟脂肪細胞去分化是脂質分解和脂質形成相互平衡的結果。此外，Jumabay 等[18]開發了一種與天花板培養法不同的方法，即將分離的脂肪細胞置于培養基中懸浮培養24 h，接著將上清液接種到載有70 μm 過濾器的培養板中培養5 d，去分化的脂肪細胞通過過濾器黏附在培養板底部，而未去分化的脂肪細胞則被去除。

體外研究證實了DFAT 細胞不能表達與成熟脂肪細胞相關的標志物，如脂聯素（Adiponectin，ADPN）、脂肪酸結合蛋白（Fatty Acid Binding Protein，FABP4）、脂蛋白脂酶（Lipoprotein Lipase，LPL）和PPARγ[19]，卻能表達與干細胞相關的標志物，如Oct4、Sox2、c-Myc和NANOG[20]，這些結果表明DFAT 細胞具有干細胞特性。同時，有研究表明DFAT 細胞在不同的誘導介質中具有不同的分化潛能，DFAT 細胞與心肌細胞共培養時能夠表達心臟標志物，表明DFAT 細胞有向心肌細胞分化的潛力[21]。DFAT 細胞在成骨誘導培養基中培養21 d 后可以表達成骨分化標志物Runt 相關轉錄因子2（Runt-Related Transcription Factor 2，Runx2），表明DFAT 細胞有向骨細胞分化的潛力[19]。

1.2 體內去分化 近年來，許多研究發現，在泌乳過程中脂肪細胞和乳腺上皮細胞的形態發生變化，乳腺導管上皮細胞擴張形成腺泡結構時，脂肪細胞丟失脂滴并去分化為成纖維細胞樣細胞[11,22-23]。Morroni 等[24]研究發現，在嚙齒類動物乳腺退化期，脂肪細胞是擴展形成乳腺的主體。因此，乳腺是研究脂肪細胞在體內生理狀態下動態變化和脂肪細胞去分化的良好模型。Liao 等[25]將組織擴張器置于大鼠腹股溝脂肪組織下，通過注水使其逐漸擴張，在不同的時間點收集腹股溝脂肪組織，并進行形態學、組織學、細胞學和基因表達分析，結果顯示擴大后的脂肪組織中的脂滴逐漸消失，變成成纖維細胞樣細胞，且PPARγ、ADPN 和C/EBPα的表達量不斷下降，提示成熟脂肪細胞發生去分化。另外，在病理條件下，成熟脂肪細胞也會發生去分化，如通過對小鼠模型進行譜系示蹤發現，在皮膚纖維化、創傷愈合和乳腺癌變等條件下[26-28]，脂肪細胞能夠發生去分化。

體內研究證實了DFAT 細胞不能表達與成熟脂肪細胞相關的標志物，如FABP4、脂肪酸合酶（Fatty Acid Synthase，FASN）、葡萄糖轉運酶-4（Glucose Transport Proteins 4，GLUT4）、瘦素（Leptin）和LPL[29]，卻能表達與前體脂肪細胞相關的標志物，如血小板源性生長因子受體α多肽（Platelet—Derived Growth Factor Receptor Alpha，PDGFRA），血小板源性生長因子受體β多肽（Platelet—Derived Growth Factor Receptor Alpha，PDGFRB）、淋巴細胞抗原6 重復位點蛋白6A 抗體（Lymphocyte Antigen 6 Complex，locus A Ly6a）、Cd34和整合素β1（Fibronectin Receptor Beta Subunit，Itgb1）[11]。有研究表明，DFAT 細胞在不同的誘導介質中具有不同的分化潛能，在大鼠急性心肌梗死模型中，移植的DFAT 細胞在梗死心肌中有效累積，并在移植8 周后表達橫紋肌肌動蛋白[21]。在大鼠椎間盤退變模型中，移植的DFAT 細胞促進了椎間盤再生，提高了椎間盤高度，提示DFAT 細胞移植可能是治療椎間盤退變的可行方法。

2 DFAT 細胞的分化潛能

目前，關于動物脂肪沉積的研究較為廣泛，但沒有關注如何合理利用成熟脂肪細胞的去分化能力靶向調控特定組織的脂肪沉積，如皮下脂肪和肌內脂肪；此外，DFAT 細胞的多向分化潛能也可以應用于臨床研究。因此，從肉類科學和機體健康的角度出發，深入了解DFAT 的多向分化潛能具有重要意義。DFAT 細胞可分化脂肪細胞、肌肉細胞、骨細胞和軟骨細胞、內皮細胞以及成神經細胞等多種細胞（圖2）。

圖2 DFAT 細胞再分化

2.1 成脂分化 許多研究證實，DFAT 細胞可以重新分化為前體脂肪細胞[16,30-31]。Takahashi 等[14]證明小鼠DFAT 細胞無需特殊處理即可成脂分化，而人類DFAT細胞則需要誘導成脂。Sun 等[32]從豬背長肌中分離純化得到成熟脂肪細胞，經天花板培養為DFAT 細胞后，在體外成脂誘導條件下，細胞質中脂質堆積且PPARγ、C/EBPα、LPL和ADPN等基因的表達模式與脂肪前體細胞誘導成脂相似，說明DFAT 細胞可以再分化為成熟脂肪細胞。此外，DFAT 細胞已被證明具有體內成脂能力，Nobusue 等[16]將DFAT 細胞和3T3-L1 細 胞直接注射到小鼠胸骨皮下，發現注射DFAT 細胞的小鼠2 周后無需誘導即可生成脂肪墊，而注射3T3-L1 細胞的小鼠并未生成新的脂肪墊。Chen 等[33]研究發現，肌內脂肪來源的DFAT 細胞的PPARγ和C/EBPα的mRNA 相對表達水平高于內臟脂肪來源的DFAT 細胞，說明肌內脂肪來源的DFAT 細胞的成脂能力強于內臟脂肪來源的DFAT 細胞。

2.2 成肌分化 DFAT 細胞可以分化為骨骼肌細胞、平滑肌細胞和心肌細胞。有研究表明，DFAT 細胞在體外成肌誘導過程中，骨骼肌細胞的標志基因生肌決定因子（Myogenic Determination Gene，MyoD）和肌細胞生成素（myogenin，myoG）的表達量顯著升高，隨后細胞融合，形成表達肌球蛋白重鏈的多核細胞[34]。這些結果表明，從成熟脂肪細胞中分離純化的DFAT 細胞可以在體外再分化為骨骼肌細胞。Pastor 等[35]將DFAT細胞移植到尿道括約肌擴張的大鼠模型中，發現對照組大鼠尿道平滑肌和外橫紋肌層萎縮，而DFAT 細胞移植組大鼠平滑肌和橫紋肌數量增加，說明DFAT 細胞有助于尿道平滑肌的恢復。此外，也有研究表明，10%～15%的DFAT 細胞能夠在體外自發分化為心肌細胞，而且將DFAT 細胞注入缺血大鼠心臟中可誘導新生血管形成并促進心臟組織的康復[21,36]。

2.3 成骨和成軟骨分化 DFAT 細胞是高度均勻同質的細胞系，在骨重建的臨床應用上具有重大潛力。有研究表明，將DFAT 細胞接種到鈦纖維網中，在成骨培養基中培養14 d，成骨細胞分化的終末期標志物骨鈣素（Osteocalcin，OCN）和鈣沉積顯著升高，說明DFAT 細胞已分化為成骨細胞[37]。Okita 等[7]用全反式視黃酸處理DFAT 細胞，發現成骨相關轉錄因子Runx2、osterix 以及骨特異性堿性磷酸酶（Bone-Specific Alkaline Phosphatase，BAP）、骨橋素（Osteopontin，OPN）、OCN 等mRNA 相對表達量顯著升高，而且，將全反式視黃酸處理過的DFAT 細胞通過擴散盒法移植到小鼠體內，可以觀察到這些細胞在無宿主細胞參與的情況下可以形成異位骨樣組織。Kishimoto 等[38]比較人DFAT 細胞和頰脂墊脂肪干細胞（Adipose-Derived Stem Cells，ASCs）的成骨分化能力發現，DFAT 細胞的BAP 含量和鈣沉積量均高于ASCs，說明DFAT 細胞的成骨分化能力強于ASCs。有研究表明，將人DFAT細胞接種到成軟骨誘導培養基后，軟骨細胞標志物II 型膠原免疫染色呈陽性，阿爾辛藍染色也呈陽性，提示有軟骨性蛋白多糖的聚集，同時，軟骨細胞早期分化標志基因SOX9 和成熟軟骨細胞標志基因蛋白多糖和蛋白聚糖的mRNA 相對表達量也顯著升高，這些結果說明人DFAT 細胞可以再分化為軟骨分化[5]。此外，Okita 等[7]將DFAT 細胞接種到含有鍶的成骨分化培養基中，14 d后發現成軟骨標志基因I 型膠原α1 鏈基因的mRNA 相對表達量顯著升高，說明鍶可以促進DFAT 細胞的成軟骨分化。

2.4 成血管分化 在血管生成過程中，由內皮細胞形成的新血管腔募集周細胞和平滑肌細胞，為血管提供一個理化環境的支持。Jumabay 等[39]觀察到，在成熟脂肪細胞去分化過程中，造血細胞相關的細胞表面抗原CD10、CD24、CD40 和髓系細胞相關的細胞表面抗原CD13、CD44、CD86 表達增加，且在基質凝膠中培養的DFAT 細胞可以形成穩定的管狀結構，并且檢測到內皮標志物CD31 和血管內皮鈣黏蛋白，提示DFAT 細胞可以重新分化為內皮細胞。在后肢缺血小鼠模型研究中，研究人員將DFAT 細胞注射到缺血性肌肉組織中，與對照組相比，DFAT 細胞移植小鼠血流量比值顯著升高、成熟血管密度顯著增加，說明DFAT 細胞在后肢缺血模型中可以促進新生血管生成和成熟；在低氧以及與血管內皮細胞共培養條件下發現，DFAT 細胞可以分泌血管生成因子，進一步通過免疫熒光染色發現DFAT 細胞可以再分化為周細胞[40]。

2.5 成神經分化 與ASCs 一樣，DFAT 細胞也具有成神經的潛力，可以表達腦源性和膠質細胞系源性神經營養因子[15]。有研究表明，DFAT 細胞可以表達巢蛋白、β3-微管蛋白和膠質纖維酸性蛋白等神經標志物，將DFAT 細胞注射到脊髓損傷誘導的運動障礙的大鼠模型體內，可促進其運動功能恢復，而且在注射部位檢測到表達β3-微管蛋白的移植細胞，同時，這些細胞也可以表達腦源性和膠質細胞系源性神經營養因子[41]。因此，推測DFAT 細胞可以再分化為神經細胞。

3 脂肪細胞去分化的調控機制

目前，關于脂肪細胞去分化已有相關研究報道，但對其去分化機制還知之甚少。一般來說，脂肪生成所需的關鍵基因和通路對脂肪細胞去分化也起到關鍵作用。研究表明，PPARγ是脂肪生成的主要調節因子[42]，TGF-β[43]、Wnt[44]和Notch[45]信號通路主要起到抑制脂肪生成的作用，這些因子和通路也與脂肪細胞去分化密切相關（圖3）。

圖3 脂肪細胞去分化的調控機制

3.1 PPARγ作為脂肪生成的主要調節因子，PPARγ在脂肪細胞的去分化過程中發揮重要作用。脂肪肉瘤是軟組織惡行腫瘤中最常見的一種，在50 多種間充質來源的惡性腫瘤中，其發病率約為20%[46]。Tontonoz 等[47]研究發現，PPARγ和類維生素A 受體的特異性配體可以刺激去分化脂肪肉瘤細胞再分化，是治療脂肪肉瘤的有效藥物。有研究表明，在Notch 信號驅動的脂肪肉瘤小鼠模型中，基因表達譜顯示PPARγ通路相關的基因及其配體被抑制，通路分析進一步揭示了PPARγ相關通路被抑制，表明PPARγ信號的缺乏是Notch 驅動脂肪肉瘤發生的主要原因，而且PPARγ激動劑羅格列酮可以有效阻止脂肪肉瘤的發生[12]。近年來，越來越多的臨床實驗利用PPARγ激動劑治療由于缺乏PPARγ引起的癌癥[48-50]。

3.2 轉化生長因子-β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β） TGF-β也被證明能夠直接調控脂肪細胞的去分化過程。有研究表明，TGF-β1 在人成熟脂肪細胞去分化過程中表達量顯著升高，而且TGF-β1 的激活可顯著促進脂肪細胞去分化[51]。在博來霉素誘導的小鼠真皮纖維化模型中，用TGF-β1 處理真皮層脂肪細胞24 h后，發現脂肪細胞特異性標志物圍脂滴蛋白（Perilipin）和成肌纖維細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白（α-Smooth Muscle Actin，α-SMA）存在共表達現象；DNA 芯片結果顯示，TGF-β1 誘導真皮層脂肪細胞纖維化過程中，與纖維生成相關的基因表達上調，而與脂肪生成相關的基因表達下調，其中Wnt5a和分泌型卷曲相關蛋白2（Secreted Frizzled Related Protein 2，FRP2）的基因表達增加，表明TGF-β1 也可以通過影響其他途徑來調控去分化[26]。

3.3 Wnt Wnt 信號通路也被證明與去分化有關，這與它抑制脂肪生成的作用一致。脂肪組織中的許多種細胞都可以分泌經典的Wnt 信號配體[52]，其中Wnt3a 配體已被確定為3T3-L1 脂肪細胞去分化的增強劑[53]，可以上調脂肪細胞中幾種典型的未分化標志物，包括前脂肪因子-1（Preadipocyte factor-1，Pref-1）、Wnt10b和GATA2[52]。在高滲環境誘導的脂肪細胞去分化模型中，10 d 后觀察到多數脂肪細胞脂滴消失，剩余脂肪細胞的數量和大小減少，同時，經典Wnt 信號通路相關基因Wnt7a、FZD5和SOX2顯著升高[54]。用Wnt 配體分泌抑制劑IWP2 處理高滲環境下的小鼠脂肪細胞發現其去分化率顯著降低，當通過添加外源性Wnt3a 配體挽救經典Wnt/β-catenin 信號通路時，高滲誘導的去分化得以恢復；等張性條件下，在無IWP2 的情況下，用外源性Wnt3a 配體處理脂肪細胞時，Wnt/β-catenin 信號通路增強，小鼠脂肪細胞去分化比例增加[54]。用3T3-L1 脂肪細胞和胰腺癌細胞在體外進行細胞遷移侵襲實驗，觀察到成纖維細胞樣細胞的出現，同時發現成熟脂肪細胞典型的標志基因Leptin、ADPN、GLUT4、HSL和PPARγ的mRNA 相對表達量顯著下降，成纖維細胞標志基因α-SMA 和脂肪生成負調控因子基質金屬蛋白酶-11（Matrix Metalloproteinase-11，MMP-11）的mRNA 相對表達量顯著升高，而且共培養的胰腺癌細胞中Wnt5a基因和蛋白在共培養早期表達增加[53]。進一步研究發現，胰腺癌細胞釋放的Wnt5a 靶向作用于3T3-L1 脂肪細胞的Wnt 信號通路，激活c-Jun 和活化蛋白-1（Activator protein-1，AP1）信號；在共培養體系中加入Wnt5a 受體競爭性抑制劑分泌型卷曲相關蛋白5（Secreted Frizzled Related Protein 5，SFRP5），可阻斷3T3-L1 細胞下游Wnt 信號，并阻止其去分化[53]。

3.4 Notch 另一個驅動去分化的信號通路是Notch 信號通路。早期的研究報道了Notch 及其配體和受體在脂肪細胞分化過程中作用并不一致，在體外環境下，Notch信號通路的激活可以抑制或促進脂肪生成[45,55-56]。Bi等[12]報道了脂肪細胞特異性激活Notch 信號（Ad/NICD）的小鼠在組織學形態、解剖定位和基因表達特征上與人去分化脂肪肉瘤相似，表現為腫瘤細胞中混雜有含脂滴的細胞，在腫瘤周圍的纖維血管間質發現了脂肪細胞，說明Notch 信號的激活可以促進成熟脂肪細胞去分化；RT-PCR 結果顯示，Ad/NICD 小鼠體內Notch信號通路相關基因Hes1、Heyl和Hey1的表達量顯著升高，用γ-分泌酶抑制劑DAPT 抑制脂肪肉瘤細胞中Notch 信號的表達后，發現Notch 信號的靶基因Hes1的表達量顯著下降，且能抑制脂肪肉瘤細胞的增殖[12]，提示Notch信號的表達可以正向調控成熟脂肪細胞去分化。

4 豬脂肪細胞去分化的研究進展

在豬上，關于脂肪細胞去分化的研究主要集中在皮下和肌內脂肪細胞去分化及其DFAT 細胞的再分化成脂等相關研究。

4.1 皮下脂肪細胞 皮下脂肪組織是研究豬脂肪細胞去分化最常用的脂肪組織。高霞等[57]采集1 月齡仔豬的背部皮下脂肪組織，經天花板培養法進行去分化，培養至12 d 時，細胞質和培養基內幾乎看不到脂滴，細胞完成去分化，接著進行成脂再分化發現，PPARγ的表達量在誘導早期較低，隨后逐漸上升，說明豬DFAT 細胞具有類間充質干細胞的特性，且具有很強的成脂再分化潛能。Peng 等[19]采集5 日齡長白豬皮下脂肪細胞進行去分化，在去分化過程中，具有單個大脂滴的圓形成熟脂肪細胞逐漸轉變為成纖維細胞樣細胞，且成脂標志物PPARγ、FABP4、LPL和ADPN的表達量顯著上升，流式細胞分析結果顯示豬DFAT 細胞與間充質干細胞具有相似的細胞表面抗原，如CD44、CD29 和CD90 等。Matsumoto 等[5]從成年公豬背部分離皮下脂肪細胞進行天花板培養，經流式細胞分析后發現，與脂肪源性干細胞或基質細胞相比，DFAT 細胞具有高度同質的細胞群；PCR 結果顯示成熟脂肪細胞相關的標志基因的表達量顯著下降，而間充質干細胞相關的標志基因（如RUNX2和SOX9）的表達量顯著升高，提示豬DFAT 細胞具有多向分化潛能。

4.2 肌內脂肪細胞 肌內脂肪沉積是影響豬肉品質的主要因素，獲得高度純化的肌內前體脂肪細胞是研究肌肉組織中脂肪細胞分化和代謝的關鍵。Sun 等[32]從豬背長肌中分離出成熟脂肪細胞，經天花板培養去分化為高度同質的DFAT 細胞，接著進行成脂誘導再分化發現，在誘導過程中，細胞質中脂質聚積且PPARγ、C/EBPα、LPL 和ADPN 的表達模式與脂肪前體細胞成脂誘導一致。Chen 等[33]從約克夏豬和長白豬的半腱肌分離出成熟脂肪細胞，去分化后接種于完全培養基中，在完全培養基中培養16 d，細胞質中脂質含量不斷增加，PCR 結果顯示C/EBPα、PPARγ、FABP4和FASN的表達量顯著升高，提示豬DFAT 細胞可以在體外自發再分化為成熟脂肪細胞。

5 小結與展望

目前，針對脂肪細胞去分化的研究大多集中在臨床醫學上（如皮膚愈合和再生、癌癥的發展、許多其他病理條件下），然而關于如何利用成熟脂肪細胞的去分化能力增加特定組織的脂肪沉積（如肌內脂肪等）卻研究甚少。因此，脂肪細胞去分化的靶向調控是提高肉品質的新途徑。盡管目前對脂肪細胞去分化的調控機制有初步認識，但仍有許多科學問題值得探究：①觸發成熟脂肪細胞去分化的核心調節網絡是什么？②不同部位成熟脂肪細胞的去分化能力是否一致？③不同脂肪組織源性的DFAT 細胞的再分化潛能和多向性是否存在差異？④DFAT 細胞重新進入成脂分化過程的啟動機制和前體脂肪細胞分化機制是否一致？⑤是否可以利用營養策略調控體內脂肪細胞去分化進而改善豬胴體性狀和肉品質？因此，關于脂肪細胞去分化的調控機制仍需深入研究，進而為脂肪細胞生物學的研究以及畜牧生產和人類機體健康調控提供理論和實踐依據。