新型白樺脂酸糖苷化衍生物的合成及體外抗A549活性

何明會, 曾麗蘭, 黨笑笑, 楊詩雯, 張勇民, 董登祥*

(1. 貴州中醫藥大學 藥學院，貴州 貴陽 550000； 2. 漳州片仔癀藥業股份有限公司，福建 漳州 363000；3. 西安解碼生物科技有限公司，陜西 西安 710000； 4. 重慶市巫山縣中醫院，重慶 404700；5. 法國索邦大學 法國國家科研中心，巴黎 75005)

白樺脂酸(betulinic acid, Chart 1)是一種天然的五環三萜類化合物，為白樺脂醇的次生代謝產物，廣泛存在于白樺樹、夏枯草、光皮木瓜、迷迭香、酸棗仁等植物中，但含量較低，即使是在白樺樹的樹皮中，含量也僅為千分之二左右[1-2]。白樺脂酸具有抗腫瘤[3-4]、抗HIV[5-8]、調血脂[9-10]、抗糖尿病[11]等多種藥理活性。大多數五環三萜類化合物都具有抗炎作用，如甘草次酸、齊墩果酸等，因此白樺脂酸也具有抗炎作用[12-13]。與傳統化療藥物相比，白樺脂酸衍生物對多種腫瘤細胞具有明顯的細胞毒性，能有效抑制其生長，且毒副作用小，可通過多種作用機制直接發揮抗腫瘤作用或與其他抗腫瘤藥聯合用藥，通過增強療效或降低毒副作用等方式間接起到抗腫瘤作用[14-16]。

Chart 1

白樺脂酸是一種具有很高研究價值的天然化合物，具有良好的抗腫瘤和抗HIV活性，特別是對黑色素瘤等腫瘤細胞，有很高的生物活性而對機體正常細胞無損害[17]。目前，對白樺脂酸的開發利用不多，制劑種類也比較單一，并且水溶性低、生物利用度不高、口服難吸收等因素也使其未應用于臨床。為了改善白樺脂酸的水溶性和生物利用度，人們進行結構改造和衍生物的合成，旨在獲得高效、低毒且藥理活性顯著的化合物。石瑋、Majeed等[18-19]對白樺脂酸進行結構修飾，合成了具有良好抗癌活性的白樺脂酸三唑衍生物。Gupta等[20]設計合成了白樺脂酸的亞芐基衍生物，并對5種腫瘤細胞的毒性進行了評價，發現在C2位進行修飾后，其抗腫瘤活性明顯增加，C2位是修飾的有利位點。

天然產物與糖片段連接后，可提高天然產物的穩定性、水溶性和生物利用度[21-22]。天然產物與糖片段通過糖苷鍵或其他化學鍵偶連后，由于連接部位不同其生物活性也可能不同。另外，糖具有許多不同的藥理作用，其生物學功能差不多涵蓋了所有的生物活性譜[23]。因此，用糖片段對天然產物進行化學結構修飾對天然產物新藥的研發具有重大意義。

本文在此基礎上，以白樺脂酸苷元為起始原料，對其28-COOH進行甲基化修飾后制得白樺脂酸-28-羧甲酯(1)。分別以D-半乳糖、D-氨基葡萄糖等為起始原料，通過對糖羥基保護與去保護，得到一系列單糖、二糖片段。通過三氯乙酰亞胺酸酯途徑合成的糖片段對1的3-位羥基進行修飾，合成了3種新型的白樺脂酸糖苷化衍生物(2～4, Scheme 1)，其結構經1H NMR、13C NMR和MS(ESI)表征。采用MTT法測試了2～4對人肺癌細胞(A549)的體外抑制活性。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WFH-203B型三用紫外分析儀；INOVA-400/500 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標)；FINNI ANLACQ-DECA型質譜儀。

D-半乳糖、D-氨基葡萄糖、α-乳糖，國藥集團化學試劑有限公司；白樺脂酸對照品，中國藥品生物制品檢定所；2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-O-D-吡喃半乳糖三氯乙酰亞胺酸酯(a)， 3,4,6-三-O-乙酰基-2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亞胺酸酯(c)， 2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-乙酰基-1-O-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亞胺酸酯(e)，實驗室自制；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)1的合成

稱取白樺脂酸1.0 g于250 mL圓底燒瓶中，加入CH3I 4 mL，四丁基氟化銨(TBFA)167 mg， 5%NaHCO360 mL和20 mL DCM，通入氮氣，攪拌下反應至終點(TLC檢測，展開劑：環己烷/乙酸乙酯(Cy/EtOAc)=2/1，V/V， Rf=0.56)。用DCM/H2O萃取，有機相層用無水MgSO4干燥，過濾，濾液濃縮，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：Cy/EtOAc=3/1)純化得白色固體197.1 mg,收率97.1%, m.p.147～148 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 4.74(d,J=1.90 Hz, 1H, 29-H), 4.60(m, 1H, 29-H), 3.67(s, 3H, OCH3), 3.18(dd,J=11.20 Hz, 5.00 Hz, 1H, 3-H), 3.00(m, 1H, 19-H), 1.73(s, 3H, 30-H), 1.66(m, 1H, 13-H), 1.62(m, 1H, 18-H), 1.60(m, 4H, 2, 16-H), 1.59(m, 2H, 22-H), 1.57(m, 2H, 1-H), 1.54(m, 4H, 12, 15-H), 1.52(m, 2H, 21-H), 1.50(m, 2H, 7-H), 1.39(m, 2H, 11-H), 1.31(m, 1H, 5-H), 1.18(m, 1H, 9-H), 0.97(s, 3H, 26-H), 0.94(s, 6H, 23, 27-H), 0.93(s, 3H, 24-H), 0.82(s, 3H, 25-H);13C NMR(CDCl3， 101 MHz)δ: 176.65(C28), 150.57(C20), 109.56(C29), 78.96(C3), 56.53(C17), 55.31(C5), 51.37(OMe), 51.27(C9), 50.51(C19), 49.42(C18), 42.36(C14), 40.63(C8), 38.84(C13), 38.68(C4), 38.23(C1), 37.16(C10), 36.95(C22), 34.28(C7), 32.15(C21), 30.57(C16), 29.65(C15), 27.38(C2), 25.80(C12), 25.48(C23), 20.85(C11), 19.65(C30), 19.35(C24), 18.27(C6), 16.10(C26), 15.34(C25), 14.69(C27); MS(ESI)m/z: 655.4{[M+Na]+}。

(2)2的合成

稱取化合物a100 mg(0.20 mmol)和1184 mg(0.39 mmol)加入100 mL圓底燒瓶中，加入分子篩和攪拌子，無水DCM 10 mL使其充分溶解，抽真空，通入氮氣；將反應體系于冰水條件下平衡20 min后加入5 μL三氟甲磺酸三甲基硅脂(TMSOTf, 0.026 mmol)，攪拌下反應至終點(TLC檢測，展開劑：Cy/EtOAc=2/1)。用適量飽和NaHCO3調至pH中性，用DCM/H2O萃取，有機相層用無水MgSO4干燥，過濾，濾液濃縮，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：Cy/EtOAc=3/1)純化得白色固體b105 mg，收率33.5%。

稱取化合物b50 mg(0.06 mmol)加入50 mL圓底燒瓶中，加入MeOH約3 mL，攪拌使其完全溶解。緩慢加入新制MeONa溶液，調pH至12～13，攪拌下反應至終點(TLC檢測，展開劑：Cy/EtOAc=1/3)。加入陽離子交換樹脂調pH至弱酸性，過濾，減壓濃縮除去甲醇，真空干燥得粗產物，用HL-20凝膠柱(洗脫劑：MeOH)純化,濃縮,殘余物真空干燥得白色固體白樺脂酸-28-羧甲酯-3-O-β-D-吡喃半乳糖基(2)34 mg,收率86.5%, m.p.165～166 ℃;1H NMR(CDCl3, 500 MHz)δ: 4.76(dd,J=7.16 Hz, 2.50 Hz, 1H, 1′-H), 4.75(dd,J=1.64 Hz, 1.52 Hz, 1H, 29-H), 4.62(m, 1H, 29-H), 3.73(s, 1H, 2′-H), 3.67(s, 3H, OCH3), 3.67(m, 3H, 3′, 6′-H), 3.66(s, 1H, 5′-H), 3.61(s, 1H, 4′-H), 3.57(m, 1H, 3-H), 3.05(m, 1H, 19-H), 2.09(dd,J=7.51 Hz, 1.46 Hz, 1H, 9-H), 1.82(m, 2H, 22-H), 1.75(m, 1H, 18-H), 1.74(s, 3H, 30-H), 1.70(m, 2H, 16-H), 1.63(m, 1H, 5-H), 1.57(m, 2H, 2-H), 1.52(m, 4H, 6, 15-H), 1.51(m, 2H, 21-H), 1.42(m, 2H, 7-H), 1.39(m, 5H, 11, 12, 13-H), 1.36(m, 2H, 1-H), 0.98(s, 3H, 23-H), 0.93(s, 6H, 24, 26-H), 0.91(s, 3H, 27-H), 0.81(s, 3H, 25-H);13C NMR(CDCl3,126 MHz)δ: 176.63(C28), 149.79(C20), 110.20(C29), 106.18(C1′), 91.96(C3), 78.45(C5′), 78.43(C3′), 75.54(C2′), 71.28(C4′), 62.83(C6′), 56.55(C5), 56.06(C17), 51.37(OMe), 51.29(C9), 49.94(C19), 49.22(C18), 42.98(C14), 42.34(C8), 40.66(C13), 39.20(C1), 39.86(C22), 38.95(C4), 37.76(C10), 32.89(C7), 31.72(C21), 29.71(C16), 29.69(C15), 26.06(C12), 25.89(C2), 22.07(C23, C24), 21.24(C11), 19.44(C30), 18.75(C6), 15.99(C26), 15.90(C25), 14.76(C27); MS(ESI)m/z: 655.4{[M+Na]+}。

(3)3的合成

稱取化合物c100 mg(0.17 mmol)和181 mg(0.17 mmol)加入100 mL圓底燒瓶中，加入分子篩和無水DCM 10 mL，攪拌使其充分溶解；抽真空，通入氮氣；將反應體系于冰水條件下平衡20 min后加入6 μL TMSOTf(0.026 mmol)，攪拌下反應至終點(TLC檢測，展開劑：Cy/EtOAc=2/1)。用適量飽和NaHCO3溶液調至pH中性，用DCM/H2O萃取，有機相層用無水MgSO4干燥，過濾，濃縮，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：Cy/EtOAc=3/1)純化得白色固體d58 mg，收率37.9%。

稱取化合物d50 mg(0.06 mmol)加入50 mL圓底燒瓶中，加入2 mL AC2O(0.02 mmol)和2 mL MeOH，通入氮氣，攪拌下反應至終點(TLC檢測，展開劑：DCM/MeOH=8/1)。減壓蒸除溶劑，殘余物用MeOH溶解，過濾，濾液減壓蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：DCM/MeOH=10/1)純化，濃縮，殘余物用HL-20凝膠柱(洗脫劑：MeOH)純化，濃縮后干燥得黃白色固體白樺脂酸-28-羧甲酯-3-O-(2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基-D-吡喃葡萄糖基)(3)47 mg,收率88.2%, m.p.183～184 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.08(d,J=9.11 Hz, 1H, N-H), 4.96(d,J=18.20 Hz, 1H, 29-H), 4.76(dd,J=6.93 Hz, 2.59 Hz, 1H, 1′-H), 4.65(m, 1H, 29-H), 3.89(s, 1H, 2′-H), 3.83(s, 1H, 3′-H), 3.66(s, 2H, 6′-H), 3.65(s, 3H, OCH3), 3.65(dd,J=7.70 Hz, 3.39 Hz, 1H, 5′-H), 3.57(s, 1H, 4′-H), 3.56(m, 1H, 3-H), 2.80(m, 1H, 19-H), 2.77(dd,J=7.33 Hz, 6.04 Hz, 1H, 18-H), 1.98(s, 3H, N-CH3), 1.91(m, 6H, 2, 16, 22-H), 1.73(s, 3H, 30-H), 1.72(m, 1H, 13-H), 1.63(m, 8H, 6, 7, 15, 21-H), 1.54(m, 4H, 11, 12-H), 1.279m, 2H, 1-H), 1.19(m, 1H, 5-H), 1.15(m, 1H, 9-H), 0.96(s, 3H, 23-H), 0.92(s, 6H, 24, 26-H), 0.85(s, 3H, 27-H), 0.82(s, 3H, 25-H);13C NMR(CDCl3, 126 MHz)δ: 175.30(C28), 150.00(C20), 107.00(C29), 99.18(C1′), 77.21(C3), 74.65(C2′), 71.43(C3′), 67.23(C4′), 65.55(C6′), 51.37(OMe), 50.20(C5′), 49.55(C5), 48.91(C17), 48.53(C9), 42.84(C14), 39.67(C8), 38.84(C19), 38.00(C18), 35.11(C13), 33.05(C4), 30.21(C10), 29.89(C7), 28.38(C1), 26.69(C15), 24.46(C16), 24.36(C12), 23.89(C2), 21.14(C11), 20.62(C21), 19.47(C23, C24), 19.44(C30), 18.35(C6), 18.31(C26), 18.21(C25), 18.10(C27); MS(ESI)m/z: 696.5{[M+Na]+}。

(4)4的合成

稱取化合物e100 mg(0.13 mmol)和1120 mg(0.25 mmol)加入100 mL圓底燒瓶中，加入分子篩和攪拌子，無水DCM 10 mL使其充分溶解，抽真空，通入氮氣；將反應體系于冰水條件下平衡20 min后加入5 μL TMSOTf(0.026 mmol)，攪拌下反應至終點(TLC檢測，展開劑：Cy/EtOAc=2/1)。用飽和NaHCO3溶液調至pH中性，DCM/H2O萃取，有機相層用無水MgSO4干燥，過濾，濃縮，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：Cy/EtOAc=3/1)，純化得白色固體f25 mg，收率17.9%。

稱取化合物f50 mg(0.05 mmol)加入50 mL圓底燒瓶中，加入MeOH約4 mL，攪拌使其完全溶解。緩慢加入新制MeONa溶液，調pH至12～13，攪拌下反應至終點(TLC檢測，展開劑：Cy/EtOAc=1/3)。加入陽離子交換樹脂調PH至弱酸性，過濾，濾液減壓濃縮除去甲醇，真空干燥得粗產物，用HL-20凝膠柱(洗脫劑：MeOH)純化，濃縮后真空干燥得白色固體白樺脂酸-28-羧甲酯-3-O-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→ 4)-D-吡喃葡萄糖基](4)25 mg, 收率68.5%, m.p.245～247 ℃;1H NMR(CDCl3, 500 MHz)δ: 4.90(d,J=15.64 Hz, 1H, 29-H), 4.79(dd,J=7.90 Hz, 2.37 Hz, 1H, 1″-H), 4.67(d,J=11.26 Hz, 1H, 29-H), 4.64(dd,J=3.45Hz , 2.89 Hz, 1H, 1′-H), 3.87(s, 1H, 5′-H), 3.84(s, 1H, 3′-H), 3.81(s, 1H, 2′-H), 3.76(m, 4H, 6′, 6″-H), 3.75(s, 1H, 2″-H), 3.70(s, 1H, 4′-H), 3.68(s, 3H, OCH3), 3.65(s, 1H, 5″-H), 3.64(s, 1H, 3″-H), 3.61(m, 1H, 3-H), 3.60(s, 1H, 4″-H), 2.86(dd,J=7.33 Hz, 6.04 Hz, 1H, 18-H), 2.05(m, 1H, 13-H), 1.95(m, 1H, 19-H), 1.78(m, 2H, 2-H), 1.75(s, 3H, 30-H), 1.70(m, 4H, 21, 22-H), 1.63(m, 8H, 6, 7, 15, 16-H), 1.55(m, 2H, 11, 12-H), 1.50(m, 2H, 1-H), 1.39(m, 1H, 9-H), 1.32(m, 1H, 5-H), 0.98(s, 3H, 23-H), 0.93(s, 3H, 24-H), 0.92(s, 3H, 26-H), 0.86(s, 3H, 27-H), 0.82(s, 3H, 25-H);13C NMR(CDCl3, 101 MHz)δ: 176.59(C28), 149.79(C20), 110.20(C29), 106.12(C1′), 104.12(C1″), 83.14(C3), 79.64(C4′), 77.46(C5″), 77.43(C3′), 76.79(C3″), 76.78(C5′), 75.07(C2′), 73.99(C2″), 71.26(C4″), 62.44(C6″), 61.42(C6′), 56.52(C5), 56.07(C17), 51.27(C9), 49.94(C19), 49.22(C18), 42.98(C14), 42.31(C8), 40.63(C4), 39.52(C13), 39.02(C1), 36.79(C10), 35.46(C22), 31.90(C21), 29.68(C15), 27.74(C12), 25.67(C2), 23.92(C23), 23.67(C24), 22.67(C11), 19.43(C30), 18.97(C6), 16.40(C26), 16.15(C25), 15.93(C27); MS(ESI)m/z: 817.4{[M+Na]+}。

1.3 生物活性測試

實驗設置3組，其中空白對照組為A549培養基，由90%F～12K無血清培養液和10%胎牛血清新配而成，阿霉素為陽性對照組，化合物2～4為實驗組。取對數生長期的肺癌A549細胞，以3×105個/mL的細胞濃度，每孔按100 uL細胞懸液隨機平行接種到96孔板內，孵育24 h后，接種藥物。在顯微鏡下觀察細胞生長狀態后加入含有不同藥物濃度(1×10-3mmol/L， 1×10-4mmol/L， 1×10-5mmol/L， 1×10-6mmol/L)的新鮮培養基。每組6個復孔，分別孵育24 h后每孔加入10 uL MTT溶液(濃度為5 mg/mL)，在5%CO2的恒溫孵育箱中繼續孵育24 h。吸去上清液，每孔加入200 uL DMSO，振蕩10 min。用酶標儀測定波長570 nm處吸光值，重復3次。

2 結果與討論

2.1 合成

采用三氯乙酰亞胺酸酯途徑合成3個白樺脂酸糖苷化衍生物。其原因在于亞胺酯合成法收率高，但其基團又容易失活，即合成三氯乙酰亞胺酸酯時，1-位的半縮醛OH被CNCCl3保護后，對質子酸較敏感，得到的產物穩定性差，必須及時使用。

合成白樺脂酸與糖片段時，在室溫條件下進行反應，產率低，而在低溫時，由于乙酰亞胺酯形成碳正離子速度減慢，與白樺脂酸苷元的羥基結合幾率明顯增加，因此實驗選擇在冰水浴條件下進行反應。

2.2 抗腫瘤活性

表1為目標化合物對A549的體外抑制活性。由表1可知，白樺脂酸C28位甲基化后，在C3位接入單糖和二糖片段得到的糖苷化衍生物(2～4)在不同濃度下對A549細胞均具有抑制活性，但均略低于阿霉素，其中化合物4在濃度1×10-3mmol·L-1時抑制率最高，達到(91.07±0.18)%，而化合物2、3在濃度1×10-3mmol·L-1時，抑制率也超過70%。

表1 目標化合物對A549的體外抑制率

合成了3種新型白樺脂酸糖苷化衍生物，并采用MTT法初步評價了化合物對人肺癌A549細胞的體外抑制活性。結果表明，白樺脂酸結構經修飾后，其抗腫瘤活性均有所提高，雖然略低于陽性對照組阿霉素，但也初步解決了白樺脂酸水溶性差、生物活性低等難題，為今后白樺脂酸的結構修飾和衍生物的開發利用提供了依據。