翼莖羊耳菊提取物對脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞RAW 264.7的抗炎作用

黃 春 麗， 吳 樂 昊， 于 洋， 金 慧 子， 張 巖

( 1.上海交通大學 藥學院， 上海 200240；2.上海交通大學 生命科學技術學院， 上海 200240 )

0 引 言

炎癥是機體對外界損傷產生的一種復雜的防御反應，在保護機體、防御外來病原體的感染中發揮重要作用。一般認為炎癥是一種有益的宿主防御系統，但是過度、失調的炎癥反應就會有害。在失調的炎癥反應中，復雜的炎癥介質包括促進炎癥的細胞因子和具有細胞毒性的細胞因子等會伴隨不同疾病的發生發展，包括肺炎[1]、關節炎[2]、慢性支氣管炎[3]、風濕病[4]等，甚至包括一些神經退行性疾病例如阿爾茨海默病[5]。近年來，各類炎癥性疾病發病率持續走高，且呈不斷上升趨勢，甚至已經成為全球性疾病[6]，尋找并發現安全有效的治療炎癥性疾病的藥物的需求在不斷上升。

炎癥性疾病的發病機理的重要特征即炎癥反應。巨噬細胞是重要的固有免疫細胞和抗原提呈細胞，炎癥發生時，巨噬細胞被招募到炎癥部位，并被外界物質刺激分泌產生細胞因子和趨化因子，同時啟動細胞內級聯反應[7]，產生炎癥。巨噬細胞被募集到炎癥部位釋放炎癥介質，在機體的炎癥反應過程中發揮重要作用[8]，因此抑制炎癥介質的釋放以及相關的信號通路的激活是緩解炎癥的重要手段。脂多糖(LPS)作為一種重要的內毒素，可以誘導巨噬細胞產生多種炎癥因子以及炎癥介質，如：腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)等[9]。LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞產生炎癥反應，是評價藥物抗炎活性以及進行機制研究的經典細胞模型[10]。

翼莖羊耳菊是我國特有的藥用植物，在云南邊陲應用廣泛，主要用作脈管炎的治療。在《滇藥錄》中記載，翼莖羊耳菊還可用于根治癰瘡腫毒，氣管炎，跌打損傷，氣虛頭昏等病癥[11]；而在《滇省志》中，其還可用于根治肺虛咳嗽等[12]。但目前對其化學成分和藥理作用尚知之甚少[13]。本研究采用脂多糖(LPS)誘導巨噬細胞產生炎癥反應，以期評價翼莖羊耳菊的抗炎活性并探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI1640培養基，Hyclone公司；胎牛血清，Gibco公司；二甲基亞砜、小白菊內酯，Sigma公司；NO試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；Trizol試劑，Thermo Fisher Scientific公司；TaKaRa試劑盒，東洋紡(上海)生物科技有限公司；SYBR Green qPCR試劑，DBI Bioscience公司；Anti-ERK抗體、Anti-P-ERK抗體、Anti-p65抗體、Anti-P-p65抗體、Anti-β-actin抗體、Anti-iNOS抗體、Anti-p38抗體、Anti-P-p38、Anti-Akt抗體、Anti-P-Akt抗體、Anti-JNK抗體、Anti-P-JNK抗體，Cell Signaling公司；ELISA試劑盒，Thermo Fisher Scientific公司、欣博盛。

小鼠巨噬細胞系RAW 264.7，中國細胞系庫(北京)。

1.2 翼莖羊耳菊的提取

將干燥的翼莖羊耳菊(鑒定人：張君，云南昆明植分生物技術有限公司)全草粉碎后，用95%的乙醇進行回流提取，獲得提取液，即為總提取物(ZT)；將總提取液在旋蒸儀上濃縮旋干，將獲得的旋干后固體用石油醚萃取，即為石油醚部位(PE)；將石油醚部位再用乙酸乙酯萃取，即獲得乙酸乙酯萃取液，進一步旋干即為乙酸乙酯部位(EA)；將乙酸乙酯萃取液進一步用正丁醇萃取，旋干即獲得正丁醇部位(n-BuOH)，剩余為水溶性組分(H2O)。

1.3 細胞培養

將小鼠巨噬細胞系RAW 264.7培養在含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 U/mL 鏈霉素的RPMI 1640完全培養基中，并放置在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中。

1.4 NO釋放實驗

將RAW 264.7巨噬細胞以3×104每孔鋪于96孔板，貼壁后分別加入對應濃度藥物和陽性對照藥物小白菊內酯(10 μmol/L)預孵育1 h后，加入100 ng/mL LPS，于37 ℃培養23 h。用Griess法測量培養基中累積的亞硝酸鹽作為NO產生的指標。將50 μL細胞培養液、50 μL Griess Ⅰ和50 μL Griess Ⅱ加入96孔板中，室溫孵育10 min，用酶標儀在540 nm處檢測其吸光度。

1.5 MTT法檢測細胞活力

RAW 264.7細胞以1.0×103每孔鋪于96孔板，貼壁后加入相應濃度藥物于37 ℃孵育24 h，加入5 mg/mL的MTT 10 μL，于37 ℃孵育 4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO，避光孵育10 min，用酶標儀在490 nm處檢測吸光度。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

采用TRIZOL法提取細胞總的mRNA，通過Nanodrop檢測mRNA的濃度以及純度。根據TaKaRa試劑盒說明進行操作，將mRNA反轉錄成cDNA，待測基因的引物作為模板，通過熒光定量PCR進行檢測。以GAPDH為內參進行定量分析，引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

1.7 蛋白免疫印跡(Western Blot)

通過十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解細胞，收集裂解后的蛋白，于99 ℃加熱10 min。通過SDS-PAGE凝膠電泳對iNOS、ERK、P-ERK、p38、P-p38、JNK、P-JNK、p65、P-p65、Akt、P-Akt蛋白進行免疫印跡檢測。通過雙色紅外激光成像儀檢測蛋白變化，用ImageJ軟件進行圖像分析并進行半定量分析。

1.8 酶聯免疫吸附(ELISA)實驗

根據IL-6、IL-1β、TNF-α的ELISA試劑盒說明書進行操作，采用夾心法檢測細胞中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。操作步驟如下：

捕獲抗體工作液100 μL過夜包被96孔板，移去液體，清洗孔板；加入100 μL待測樣品，并在室溫孵育2 h，移去液體并清洗孔板；加入100 μL檢測抗體工作液，室溫孵育1 h，棄去液體并清洗孔板；加入100 μL酶結合物工作液，室溫孵育30 min 棄去上清液并清洗孔板；加入100 μL底物顯色液(TMB)，孵育15 min，加入50 μL終止液，立即用酶標儀于450 nm波長處測量吸光度。

1.9 統計學分析

使用GraphPad Prism 8.3(GraphPad，Avenida，CA，USA)統計數據，結果表示為(平均值±標準誤差)。采用t檢驗分析數據，當P<0.05 時，認為結果差異性有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 翼莖羊耳菊組分對LPS誘導的RAW 264.7細胞產生NO的影響

NO的產生是RAW 264.7細胞產生炎癥反應的顯著標志之一，因此檢測藥物孵育后對LPS誘導的RAW 264.7細胞上清液中NO含量的影響，可以作為評價藥物抗炎活性的評價指標之一[15]。本研究根據組分極性的差異，將翼莖羊耳菊提取物分為n-BuOH、PE、EA和水溶性組分。通過檢測所得組分對LPS誘導的RAW 264.7細胞NO釋放的影響進行抗炎活性評估，小白菊內酯(P)作為陽性對照。如圖1(a)所示，LPS刺激23 h后，RAW 264.7細胞上清液NO濃度明顯上升，而組分n-BuOH、PE和EA在50和10 μg/mL對LPS誘導RAW 264.7細胞產生的NO均有不同程度的抑制效果，其中EA效果最優。因此，在后續的實驗中，以EA為主要研究對象。

測定了乙酸乙酯組分對NO抑制作用的劑量效應曲線，如圖1(b)所示，可見乙酸乙酯組分可以劑量依賴的抑制LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞釋放NO，由劑量效應曲線得IC50為1.675 μg/mL。

為了排除細胞活力對NO釋放的影響，采用MTT的方法檢測不同劑量下藥物對細胞活力的作用。MTT結果如圖1(c)所示，在50 μg/mL劑量下，乙酸乙酯組分對細胞活力影響較為顯著，因此，選擇5、10、20 μg/mL進行后續實驗。

P，小白菊內脂-陽性組；C，空白組；LPS，陰性組與空白組相比，####P<0.000 1；與陰性組相比，**P<0.01，***P<0.001，*****P<0.000 1

2.2 翼莖羊耳菊乙酸乙酯組分[IP(EA)]對RAW 264.7細胞中iNOS mRNA及其蛋白表達水平的影響

NO是機體內重要的信號分子，參與細胞信息交流，具有調節免疫、炎癥等重要的生理功能，在生物體內NO的合成受到一氧化氮合成酶(NOS)的調控[16]。在巨噬細胞中NO主要由誘導型一氧化氮合酶(iNOS)催化合成[17]。iNOS在巨噬細胞當中同時也是協助其進行免疫反應的一類酶。檢測藥物對iNOS表達量的影響可以進一步考察藥物是否通過調控iNOS從而對NO產生抑制作用的。本研究從mRNA和蛋白水平分別檢測了iNOS表達的變化。RAW 264.7細胞與IP(EA)預孵育1 h后，加入LPS刺激23 h，發現IP(EA)能夠劑量依賴性地降低LPS誘導產生的iNOS mRNA的表達(圖2(a))和蛋白的表達水平(圖2(b))。研究結果表明，IP(EA)通過抑制iNOS的表達抑制了NO的產生。

(a) IP(EA)對LPS誘導iNOS的影響

2.3 IP(EA)對LPS誘導RAW 264.7細胞產生IL-6、IL-1β、TNF-α的影響

IL-1β、IL-6以及TNF-α在炎癥反應中起到促進炎癥的作用，屬于促炎因子，可以分別與靶細胞膜上的相應受體結合激活炎癥相關的信號通路，從而影響炎癥反應的進程[18]。RAW 264.7作為小鼠的巨噬細胞系在被LPS等物質的刺激情況下可以分泌大量的炎性因子，在促進炎癥的發生發展中起到重要作用[18]。本研究從mRNA水平和蛋白水平考察了IP(EA)是否能夠抑制 IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的產生。如圖3(a)～(c)所示，RAW 264.7細胞在LPS刺激下IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表達水平顯著上升，而IP(EA)給藥組能夠濃度依賴性的抑制這些炎癥因子的表達。ELISA檢測結果(圖3(d)～(f))表明，RAW 264.7細胞在LPS刺激下IL-6、IL-1β、TNF-α的蛋白表達量顯著升高，而IP(EA)在5、10、20 μg/mL能夠濃度依賴地顯著抑制LPS誘導的IL-6蛋白水平，在10和20 μg/mL能夠顯著降低IL-1β和TNF-α的表達。

(a) 對IL-6 mRNA水平的影響

2.4 IP(EA)對LPS誘導的MAPK通路的影響

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是細胞內一條非常重要的信號通路，主要包括細胞外信號調節激酶(ERK通路)、p38絲裂原蛋白激酶(p38通路)和c-Jun氨基末端激酶(JNK通路)3個亞族[19]。MAPK信號通路是重要的炎癥相關的經典通路，MAPK的3個亞族ERK、JNK、p38都和炎癥相關，這些通路的激活將促使細胞釋放IL-6、IL-1β等炎癥相關物質。在RAW 264.7細胞未被激活處于靜息狀態時，MAPK通路不會被激活；而RAW 264.7細胞在LPS刺激下，MAPK通路會被迅速激活，ERK、p38、JNK等通路會發生磷酸化[20]。為了探究IP(EA)是否是通過抑制MAPK信號通路而發揮抗炎作用，IP(EA)與RAW 264.7細胞孵育1 h后，LPS刺激30 min，采用蛋白免疫印跡檢測磷酸化的ERK、p38、JNK。如圖4(a)～(c)所示，LPS能夠顯著提高ERK、p38、JNK的磷酸化，而IP(EA)在10和20 μg/mL 條件下能夠劑量依賴性地顯著抑制這些蛋白的磷酸化。因此，IP(EA)是通過抑制MAPK通路而發揮抗炎活性的。

(a) 對ERK蛋白磷酸化的影響

2.5 IP(EA)對LPS誘導的Akt/NF-κB通路的影響

NF-κB信號通路的激活可誘導炎癥因子如TNF-α、趨化因子以及一些和炎癥級聯放大相關的酶如iNOS等的過度表達，從而導致炎癥的發生[14]。NF-κB家族包括p65(RelA)、C-Rel、RelB、p50/NF-κB1和p52/NF-κB2五個部分。NF-κB信號通路的激活是LPS誘導iNOS以及多種炎癥因子大量表達的關鍵通路[21]。因此，檢測了IP(EA)是否抑制LPS誘導的NF-κB信號通路的活化。在細胞處于非激活狀態下，p65與IκB蛋白結合并處在細胞質中，而一旦細胞受到外界刺激，IκB蛋白上游激酶磷酸化激活，使得IκB降解，從而釋放出p65并進入細胞核，同時p65磷酸化[22]。本實驗中，如圖5(a)所示，LPS刺激RAW 264.7細胞后，p65的磷酸化顯著增加，而IP(EA)能夠顯著抑制p65的磷酸化。

蛋白激酶B(Akt)蛋白是由原癌基因編碼的一種絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，有研究表明Akt處于NF-κB的上游，其磷酸化會激活NF-κB信號通路，從而進一步調控細胞增殖、炎癥反應等生理過程[23-24]。Akt作為IκB蛋白上游激酶，Akt發生磷酸化時會導致p65活化。因此，進一步檢測IP(EA)對AKT磷酸化的影響，如圖5B所示，LPS能夠顯著誘導Akt的磷酸化，而IP(EA)能夠劑量依賴性的降低LPS誘導的Akt的磷酸化。由此表明，IP(EA)是通過抑制Akt/NF-κB信號通路從而發揮抗炎作用。

(a) 對p65蛋白磷酸化的影響

3 結 論

研究發現，翼莖羊耳菊提取物的乙酸乙酯組分抗炎活性最為明顯，在LPS誘導的RAW 264.7細胞上，IP(EA)可以通過影響iNOS的表達而抑制細胞內NO的產生；在mRNA以及蛋白水平均可以顯著抑制炎性因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的表達。IP(EA)顯著抑制了LPS誘導的RAW 264.7細胞內MAPK、p65以及Akt的磷酸化，表明MAPK、NF-κB以及Akt信號通路參與了IP(EA)的抗炎過程。