同位素稀釋超高效液相色譜串聯(lián)質譜法檢測血漿18-羥皮質酮方法的建立及初步臨床應用

尹逸叢，禹松林，于佳磊，王丹晨，馬超超,2，鄒雨桐,2，謝少偉，程 倩，邱 玲

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科 疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，北京 100730 2中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100005

原發(fā)性醛固酮增多癥(primary aldosteronism, PA)是一種以高血壓、高醛固酮、低血鉀及低腎素為主要特征的臨床綜合征。與同等程度的原發(fā)性高血壓相比，PA與心血管疾病、腎臟疾病的患病率及死亡率增加關系更為密切[1- 3]。PA的診斷和分型一直是臨床難點，目前常采用的定性診斷方法腎上腺CT對PA主要亞型(醛固酮瘤與特發(fā)性醛固酮增多癥)難以作出鑒別診斷，易誤診[3- 5]。雙側腎上腺靜脈取血對PA的診斷以及分型具有較高的靈敏度和特異度，但其為有創(chuàng)檢查且費用高昂，無法作為篩查手段廣泛應用。

18-羥皮質酮(18-Hydroxycorticosterone, 18-OHB)是醛固酮生物合成過程中生成的前體物質，在醛固酮合酶(少部分由11β-羥化酶催化)的催化下由皮質酮轉化而來，正常人群血漿含量極低[6- 7]。PA患者血清鈉離子濃度降低及血管緊張素Ⅱ水平升高可促進醛固酮的合成，血漿18-OHB水平亦隨之升高[8]。既往文獻報道，18-OHB在醛固酮瘤與特發(fā)性醛固酮增多癥的鑒別診斷中發(fā)揮重要作用[9- 11]，且醛固酮瘤患者仰臥位時的血漿18-OHB水平與正常受試者或特發(fā)性醛固酮增多癥患者的18-OHB水平無重疊，可用于PA的診斷以及分型鑒別。目前，18-OHB的檢測方法主要為放射免疫分析法[9]和酶聯(lián)免疫吸附法[12- 13]，但存在免疫學交叉干擾及放射性污染等局限性。超高效液相色譜串聯(lián)質譜法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)基于對離子對的檢測，特異度高，且可避免交叉反應的干擾，準確性亦較高。本研究試圖建立一種同位素稀釋UPLC-MS/MS(isotope dilution UPLC-MS/MS, ID-UPLC-MS/MS)檢測血漿18-OHB的方法，并初步用于臨床樣本檢測。

1 材料與方法

1.1 一般材料

回顧性收集2018年9月至12月北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科臨床檢測剩余血漿制備的混合血漿標本，用于該方法性能評價。

本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會審批(倫理號：HS- 1783)。

1.2 性能評價方法

1.2.1 儀器與試劑

主要儀器LC-MS/MS系統(tǒng)包括Waters Acquity UPLC色譜儀系統(tǒng)(美國Waters公司)和Waters XEVQ TQ-S串聯(lián)四極桿質譜儀(美國Waters公司)，其他儀器包括96孔正壓提取裝置(美國Waters公司)。主要試劑包括18-OHB標準品(濃度100 mg/L)購自美國Sigma公司，同位素氚標記的內標18-OHB(18-OHB-d4，濃度100 mg/L)購自美國Iso Science公司，色譜級甲醇、乙腈及正己烷購自美國Fisher Scientific公司，甲酸購自美國Sigma公司,氟化銨購自國藥集團化學試劑有限公司,無激素血漿購自美國Seracare公司。

1.2.2 分析條件

(1)色譜分析條件：色譜柱為Waters ACQUITY BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，粒徑1.7 μm)，以純水為流動相A，乙腈為流動相B。采用梯度洗脫：0～2.5 min 75% A相，2.5～3.0 min 65% B相，3.0～4.0 min 5% A相，4.0 min 75% A相，流速0.4 mL/min。柱溫為50 ℃，進樣10 μL。(2)質譜分析條件：采用正離子電噴霧離子化的多離子反應監(jiān)測模式(multiple reaction monitor，MRM)。18-OHB的MRM檢測離子對為m/z 363.16>269.075(定量用)，363.16>146.99(定性用)；18-OHB-d4的MRM檢測離子對為367.16>273.026。去溶劑氣壓為1100 psi，碰撞氣為8 psi，噴霧電壓為-4500 V，去溶劑溫度為550 ℃。

1.2.3 樣本前處理

1.2.3.1 標準溶液和內標溶液的配制

(1)標準溶液：取10 μL 18-OHB標準品原液(濃度100 mg/L)與990 μL 甲醇溶液，混勻后得到濃度為1 mg/L的18-OHB標準溶液，取100 μL濃度為1 mg/L的18-OHB標準品與900 μL 甲醇溶液混合后得到濃度為100 μg/L的18-OHB標準溶液。之后用無激素血漿將濃度為100 μg/L的18-OHB標準溶液按比例稀釋至濃度為10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 μg/L的標準溶液。(2)先取10 μL 18-OHB-d4溶液與990 μL甲醇溶液混勻后得到濃度為1 mg/L的18-OHB-d4溶液，取100 μL濃度為1 mg/L的18-OHB-d4溶液與900 μL甲醇溶液混合后得到濃度為100 μg/L的18-OHB-d4溶液，之后取200 μL濃度為100 μg/L的18-OHB-d4溶液與800 μL甲醇溶液混勻，準確配制濃度為20 μg/L的儲備內標溶液。使用時用50%甲醇水溶液將儲備內標溶液稀釋為2 μg/L的工作液。標準溶液和內標溶液均分裝于1 mL安瓿瓶中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 樣本去蛋白

取血漿標本或標準溶液200 μL，分別置于1.5 mL離心管中，加入內標工作液20 μL、甲醇300 μL，以沉淀蛋白；將混合液振蕩混勻，加入400 μL純水稀釋，振蕩混勻，13 000g離心10 min收集上清液。

1.2.3.3 樣本萃取

采用Waters Oasis Prime HLB Elution 96孔SPE板對去蛋白后的樣本進行抽提和萃取。每孔預先加入甲醇和純水各200 μL進行活化。取750 μL去蛋白后的上清液至SPE板孔位，用正壓力氮吹儀吹下并丟棄廢液。之后依次加入10%乙腈水、正己烷各200 μL，以洗脫親水、親有機相以及不同極性的雜質。每個樣品孔加入70%甲醇水溶液50 μL進行洗脫。收集洗脫液，加入40 μL純水，混勻，2485g離心10 min后上機檢測。

1.3 性能評價指標

1.3.1 精密度評價

血漿標本共分裝3份，分別加入不同濃度的18-OHB標準品制備低、中、高3個水平(濃度分別為0.2、0.5、2.0 μg/L)的待測樣本，每批次各濃度樣本均檢測5份，重復5個工作批次(約30 d完成)。計算該方法的重復性及實驗室內不精密度，重復性以變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)表示，CV<15%可接受。

1.3.2 加標回收率試驗

取180 μL混合血漿，分別添加20 μL不同濃度的18-OHB標準品，制備18-OHB濃度為0.2、0.5及2 μg/L的待測樣本，每個濃度水平平行處理5份樣本，檢測后取均值，并與理論值進行比較，計算加標回收率=實測值/理論值×100%。加標回收率在80%～120%為可接受。

1.3.3 定量檢測下限

取濃度為1 μg/L的18-OHB標準品，用無激素血漿分別稀釋至0.005、0.01、0.02 μg/L，每個濃度重復檢測20次，定量下限應滿足CV≤20%(重復檢測20次的CV)信噪比(S/N)≥10且百分偏倚≤10%。

1.3.4 線性評估

取濃度為100 μg/L的18-OHB標準品，用無激素血漿按比例分別稀釋為10、5、2、1、0.5、0.2及0.1 μg/L，參照上述步驟進行樣本前處理后按濃度由低至高依次測定18-OHB濃度。以標準溶液濃度為X軸，標準品和內標峰面積的比值為Y軸進行線性回歸分析，經(jīng)“1/X”加權得到回歸方程。將樣品峰面積比代入標準曲線方程，計算各濃度點18-OHB水平，重復測定2次取均值為最終結果，并計算各濃度的檢測偏倚，百分偏倚≤10%為可接受。

1.3.5 基質效應評估

取7份混合血漿樣本，經(jīng)樣本前處理、上機檢測獲取其樣本峰面積與內標峰面積之比(P0)。分別向樣本中加入0.5、2、10 μg/L的18-OHB標準品10 μL，再次上機檢測獲取樣本峰面積與內標峰面積之比(分別為P1、P2和P3)。取未經(jīng)樣本前處理、溶于40%甲醇水溶液、濃度分別為0.5、2、10 μg/L的18-OHB標準品，經(jīng)上機檢測獲得其樣本與內標峰面積之比(P’)，計算基質效應=(Pn-P0)/P’%。基質效應在1±20%內為可接受。

1.4 初步臨床應用

1.4.1 健康志愿者招募

2019年11月起于北京協(xié)和醫(yī)院招募表觀健康志愿者，采集其空腹靜脈血測定18-OHB濃度，用于驗證梅奧醫(yī)學實驗中心提供的18-OHB參考范圍。

表觀健康志愿者納入標準：(1)年齡>18歲；(2)漢族(包括其父母)；(3)自覺身體健康，無身體不適；(5)在現(xiàn)居住地居住1年以上。排除標準：(1)處于妊娠期或近1年內有妊娠史的女性；(2)合并心血管疾病(高血壓、冠心病、心肌炎、心力衰竭等)、肝腎功能異常、高血脂、腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(垂體、下丘腦疾病；內分泌、代謝或神經(jīng)系統(tǒng)疾病)、自身免疫性疾病(類風濕性關節(jié)炎、狼瘡性疾病)；(3)近1個月有可能引起血壓波動藥物(止痛藥、避孕藥、感冒藥、中藥、生長激素、促紅細胞生成素、類固醇激素等)或近2周有抗生素服用史；(4)近1個月定期值夜班或近1周作息明顯紊亂者；(5)近3個月內獻血者；(6)合并病毒性肝炎或自身免疫缺陷疾病；(7)體質量指數(shù)>28 kg/m2或<18 kg/m2者。

1.4.2 驗證方法

上午7∶00至9∶00，采集表觀健康志愿者空腹靜脈血標本6 mL(EDTA-K2抗凝)，抽血前保持非臥位至少2 h。離心后分離血漿，應用本研究建立的方法(ID-UPLC-MS/MS)檢測18-OHB濃度，并對梅奧醫(yī)學實驗中心提供的18-OHB參考范圍進行驗證。梅奧醫(yī)學實驗中心提供的18-OHB參考范圍：正常成人上午8∶00立位18-OHB參考范圍為0.05～0.46 μg/L。10%以上的人群血漿18-OHB檢測值超出參考范圍上下限即視為驗證不通過。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0及Excel 2016軟件進行統(tǒng)計分析。采用Shapiro-Wilk檢驗評估計量資料是否符合正態(tài)分布。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù))表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 色譜分析圖

18-OHB標準品(5 μg/L)及內標的保留時間約為1.75 min，分析時間約為3.0 min，分離良好、無干擾，見圖1。

2.2 精密度評價

ID-UPLC-MS/MS檢測低、中、高3個水平18-OHB的實驗室內不精密度為3.7%～5.0%，重復性CV為2.2%～3.5%，均為可接受、滿足檢測要求，見表1。

2.3 加標回收率

ID-UPLC-MS/MS法檢測18-OHB標準品的濃度分別為0.2、0.5及2 μg/L，平均加標回收率分別為98.1%(95.0%～99.2%)、98.4%(96.2%～102.3%)及101.7%(100.1%～104.2%)，提示18-OHB的加標回收率在可接受范圍內，檢測數(shù)據(jù)可靠。

2.4 定量檢測下限

對濃度為0.005、0.01和0.02 μg/L的標準品，分別重復檢測20次，CV分別為35.04%、12.77%和5.24%，0.01和0.02 μg/L標準品的百分偏倚≤10%且S/N≥10，故本研究建立的ID-UPLC-MS/MS法檢測18-OHB的定量檢測下限為0.01 μg/L。

2.5 線性評估

ID-UPLC-MS/MS法測定的18-OHB在0.02～10 μg/L范圍內線性良好(r>0.990)，對不同濃度的18-OHB檢測偏倚為-7.4%～3.8%，見圖2。

2.6 基質效應評估

7份混合血漿樣本的基質效應為86.83%～119.00%，提示血漿基質對低、中、高濃度18-OHB的檢測結果無明顯影響(圖3)。

圖 1 18-OHB標準品及血漿樣本同位素稀釋超高效液相色譜串聯(lián)質譜法分析圖

圖 2 18-羥皮質酮線性評估圖

圖 3 18-羥皮質酮的基質效應評估

2.7 臨床樣本中18-羥皮質酮的測定

共納入73名表觀健康志愿者用于驗證ID-UPLC-MS/MS,檢測臨床樣本血漿18-OHB濃度。其中男性29名(年齡為22～67歲，中位年齡為42歲)，女性44名(年齡為20～65歲，中位年齡為43.5歲)。經(jīng)ID-UPLC-MS/MS測定，其血漿18-OHB濃度為0.01～0.68 μg/L，中位數(shù)(四分位數(shù))為0.03(0.02，0.10)μg/L，第2.5、97.5百分位數(shù)為0.01、0.60 μg/L。男性志愿者血漿18-OHB濃度的中位數(shù)(四分位數(shù))為0.14(0.04，0.30)μg/L，女性為0.03(0.02，0.03)μg/L。Mann-WhitneyU檢驗顯示，男性志愿者血漿18-OHB濃度高于女性(P=0.000)。其中，66%(48/73)18-OHB水平處于梅奧醫(yī)學實驗中心提供的參考范圍外，提示驗證不通過。

表 1 18-OHB精密度評價結果

3 討論

本研究嘗試建立一種血漿18-OHB檢測方法，以用于PA的診斷和分型。分別從ID-UPLC-MS/MS檢測18-OHB的精密度、加標回收率、定量檢測下限、基質效應等方面對該方法的性能進行評估。結果顯示，18-OHB及內標的保留時間約為1.75 min，分析時間約為3.0 min；基質效應為86.83%～119.00%，實驗室內不精密度為3.7%～5.0%，重復性CV為2.2%～3.5%，平均加標回收率為98.1%～101.7%，定量檢測下限為0.01 μg/L，提示ID-UPLC-MS/MS對血漿18-OHB分離良好、無干擾，血漿基質對18-OHB檢測結果無明顯影響，方法準確、靈敏度高、重復性好，檢測數(shù)據(jù)可靠、可滿足檢測要求。進一步將其應用于臨床樣本18-OHB的測定，結果顯示基于該方法建立的表觀健康人群血漿18-OHB的第2.5分位數(shù)和第97.5分位數(shù)分別為0.01、0.60 μg/L。

作為一種繼發(fā)性高血壓，PA的臨床表現(xiàn)及生化檢查與原發(fā)性高血壓具有一定相似度，常規(guī)檢查在PA的鑒別診斷中應用受限。同時，PA屬于異質性較強的一類疾病，分型不同治療方式亦存在差異，因此，早期對PA進行診斷，并明確其分型，有助于精準治療，以改善患者預后、降低并發(fā)癥發(fā)生。18-OHB是腎上腺產生的一種兼具醛固酮、皮質醇結構特征的21-碳類固醇，具有排鉀保鈉的作用，高血壓患者血漿18-OHB表達增高，且不同類型高血壓中其升高的程度不同。一項研究比較了62例原發(fā)性高血壓、20例醛固酮腺瘤和62例特發(fā)性醛固酮增多癥患者血漿18-OHB表達的差異[14]，結果顯示醛固酮腺瘤組和特發(fā)性醛固酮增多癥組患者血漿18-OHB明顯高于原發(fā)性高血壓組，且醛固酮腺瘤組高于特發(fā)性醛固酮增多癥組。Phillips等[15]研究顯示，在體位試驗時18-OHB水平能較好區(qū)分醛固酮腺瘤與特發(fā)性醛固酮增多癥(18-OHB均值：142.1 ng/L比 38.8 ng/L)。

18-OHB的檢測方法包括放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法及液相色譜串聯(lián)質譜法(iquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)，但放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法因存在免疫反應的非特異交叉干擾及放射性污染等問題而應用受限。LC-MS/MS是將色譜的高效分離能力和質譜的高特異度、高靈敏度相結合的分離分析技術，同時具有樣本用量少、高通量、檢測速度快的優(yōu)勢，在臨床中有更廣泛的應用前景。Auchus等[16]應用LC-MS/MS檢測PA患者血漿18-OHB濃度，但其使用的內標是氚標記的地塞米松而非同位素標記的同種物質。Makowski等[17]建立了18-OHB的LC-MS/MS檢測方法，但該方法的實驗室內不精密度較差(12.32%～35.27%)，加標回收率較低(62%～76%)。UPLC-MS/MS在LC-MS/MS基礎上進一步提高了檢測效率及檢測的靈敏度，而ID-UPLC-MS/MS不僅可減小樣品前處理造成的誤差，且檢測的特異度更高，是目前使用最廣泛的LC-MS/MS檢測方法。本研究以同位素氚標記的18-OHB為內標嘗試建立血漿18-OHB的ID-UPLC-MS/MS檢測方法。結果顯示，18-OHB及內標的保留時間約為1.75 min，分析時間約為3.0 min，提示該方法對18-OHB的分離性良好，分析結果無干擾。且實驗室內不精密度≤5.0%，重復性CV≤3.5%，提示其對18-OHB的檢測符合臨床要求。

進一步從加標回收率、定量檢測下限、線性評估、基質效應等方面對該檢測方法進行性能評估。加標回收率用于衡量該方法檢測待檢物質的可行性，其數(shù)值在80%～120%認為較合適。線性評估用于反映檢測方法對一定范圍內待檢物質的檢測偏倚，其相關系數(shù)r>0.99且百分偏倚≤10%為可接受。基質效應用于衡量基質對待檢物質的影響，其值在1±20%內可接受。本研究ID-UPLC-MS/MS檢測血漿18-OHB的平均加標回收率為98.1%～101.7%，檢測偏倚為-7.4%～3.8%，基質效應為86.83%～119.00%，提示血漿基質對18-OHB檢測結果無明顯影響、檢測數(shù)據(jù)可靠，檢測血漿18-OHB具有可行性。梅奧醫(yī)學實驗中心提供的正常成人血漿18-OHB參考范圍為0.05～0.46 μg/L，臥位原發(fā)性高血壓、特發(fā)性醛固酮增多癥、醛固酮腺瘤患者分別為0.567(0.462，0.695)μg/L，0.654(0.513，0.835)μg/L，1.090(0.792，1.324)μg/L[14]。本研究ID-UPLC-MS/MS測定血漿18-OHB的下限為0.01 μg/L，提示可滿足臨床需求。

在上述結果的基礎上，本研究對招募的73名表觀健康志愿者采用ID-UPLC-MS/MS進行血漿18-OHB測定，初步用于臨床樣本分析。結果顯示，ID-UPLC-MS/MS檢測的73名表觀健康志愿者清晨空腹非臥位血漿18-OHB參考區(qū)間為0.01～0.68 μg/L；男性志愿者血漿18-OHB水平高于女性，與既往放射免疫法測定的血漿18-OHB不存在性別差異的結果不相符[18]。可能與納入的受試者較少或受試者年齡不同有關。經(jīng)比較，66%(48/73)18-OHB水平處于梅奧醫(yī)學實驗中心提供的參考范圍外，可能原因：(1)血漿18-OHB水平受人群攝鹽量的影響，本研究招募的志愿者未要求嚴格控制攝鹽量，為普鈉狀態(tài)下采集血液標本。歐美人群與中國人群的飲食習慣、攝鹽量差異大，導致本檢測結果與梅奧醫(yī)學實驗中心提供的參考范圍存在差異。(2)血漿18-OHB水平受體位的影響，梅奧醫(yī)學實驗中心提供的參考范圍為立位時的數(shù)據(jù)，為提高受試者的依從性，本研究要求受試者在非臥位狀態(tài)(包括坐位和立位)下采血，影響檢測結果；(3)血漿18-OHB水平可能存在種族差異，因此本實驗室后續(xù)考慮建立基于中國人群的18-OHB參考區(qū)間。

本研究局限性：(1)缺乏18-OHB測定的穩(wěn)定性研究，穩(wěn)定性實驗是長期觀察性研究，今后應補充相關工作。(2)因未成功驗證梅奧醫(yī)學中心的18-OHB參考范圍，因此應擴大人群招募數(shù)量，建立本實驗室的18-OHB參考區(qū)間。(3)因血漿18-OHB可能與攝鹽量相關，今后的實驗設計應考慮到攝鹽量與18-OHB的關系。

綜上，本研究成功建立了基于ID-UPLC/MS/MS的血漿18-OHB檢測方法，測定結果準確、可靠且快速，適用于臨床檢測，為PA的診斷及鑒別診斷提供了方法學基礎。此外，本實驗室已成功建立了基于該平臺的醛固酮檢測方法[19]。期待未來研究納入更多病例，以探究血漿18-OHB與其下游代謝產物醛固酮的相關性。

作者貢獻：尹逸叢負責實驗設計、病例招募、數(shù)據(jù)采集與整理、統(tǒng)計分析、論文撰寫；禹松林參與實驗設計、數(shù)據(jù)整理、論文撰寫；于佳磊參與實驗設計、實驗操作；王丹晨、馬超超、鄒雨桐負責病例招募、數(shù)據(jù)采集與整理；謝少偉、程倩負責樣本采集、實驗操作；邱玲參與實驗設計、病例招募、數(shù)據(jù)采集與整理，負責論文修訂與審核。

利益沖突：無