KL- 6在非小細(xì)胞肺癌術(shù)后輔助治療性肺損傷中的診斷價(jià)值

吳麗娜，高 弋，李沃松，劉 勇，秦曉松

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽(yáng) 110004

肺癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位，由于早期無(wú)明顯癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)，5年總生存率僅為19.7%[1]。近年來(lái)，隨著手術(shù)方式的改進(jìn)，術(shù)后放化療、靶向治療、免疫治療[2]等快速發(fā)展，肺癌患者的生存期及生活質(zhì)量有望得到進(jìn)一步改善。但放化療在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體正常組織也會(huì)造成損傷，如化療藥物導(dǎo)致的藥物性肺損傷(drug induced lung injury,DILI)[3]及放療導(dǎo)致的放射性肺損傷(radiation induced lung injury,RILI)[4]是肺癌患者術(shù)后輔助治療的常見(jiàn)并發(fā)癥，如不及時(shí)診斷與治療，可發(fā)展為肺間質(zhì)纖維化，嚴(yán)重者可因呼吸衰竭而死亡。

涎液化糖鏈抗原- 6(kreb von den lungen- 6,KL- 6)是分子量約為200 kD的大分子量黏液糖蛋白，生理狀態(tài)下主要表達(dá)于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、細(xì)支氣管上皮細(xì)胞，具有促進(jìn)肺纖維細(xì)胞存活、遷移和增殖的作用，有望成為特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的藥物治療靶點(diǎn)[5- 6]。與目前應(yīng)用的肺損傷診斷、病情監(jiān)測(cè)工具如高分辨率計(jì)算機(jī)斷層掃描(high resolution computed tomography,HRCT)、支氣管鏡檢查、肺活檢、連續(xù)肺功能測(cè)試等相比，血清KL- 6檢測(cè)具有創(chuàng)傷小、費(fèi)用低、結(jié)果準(zhǔn)確、可重復(fù)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。目前血清KL- 6在肺癌輔助治療性肺損傷中的研究主要集中于日本人群，已有文獻(xiàn)報(bào)道血清KL- 6的表達(dá)存在種族差異[7]。本研究以206例原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者為研究對(duì)象，旨在探討血清KL- 6在中國(guó)人群NSCLC患者術(shù)后輔助治療性肺損傷中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

1.1.1 研究對(duì)象

本研究為回顧性分析，以NSCLC患者(包括術(shù)后采用輔助治療者和僅手術(shù)者)及健康成人為研究對(duì)象。NSCLC術(shù)后輔助治療、NSCLC手術(shù)患者分別來(lái)自2017年11月—2020年7月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腫瘤科和胸外科，健康成人來(lái)自同期中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院體檢中心(健康對(duì)照組)。

輔助治療性肺損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)如下。DILI診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：(1)有致肺損傷藥物攝入史；(2)有藥物致肺損傷的臨床表現(xiàn)，且可排除其他原因；(3)影像學(xué)證實(shí)肺部有間質(zhì)性肺損傷改變；(4)停止化療后患者臨床表現(xiàn)得到改善。RILI診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：(1)有肺部放療史；(2)肺部有相應(yīng)的影像學(xué)改變，其中1級(jí)RILI僅有影像學(xué)改變，≥2級(jí)伴有咳嗽、氣短、發(fā)熱等臨床癥狀；(3)排除其他原因?qū)е碌姆螕p傷。遵循上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，由兩名肺部腫瘤高年資醫(yī)生、一名呼吸放射高年資醫(yī)生共同完成DILI、RILI的診斷。

NSCLC患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)NSCLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)原發(fā)性肺癌診療指南2019》[9]，且經(jīng)術(shù)后組織病理活檢證實(shí)；(2)TNM分期為Ⅱ～Ⅲ期；(3)術(shù)后輔助治療患者耐受性較好，可接受化療、放療，具體治療方法符合指南規(guī)定[9]；(4)行肺癌切除術(shù)患者手術(shù)方式包括胸腔鏡解剖性肺切除聯(lián)合肺門(mén)縱隔淋巴結(jié)清掃術(shù)、機(jī)器人輔助解剖性肺切除聯(lián)合肺門(mén)縱隔淋巴結(jié)清掃術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并精神疾病或認(rèn)知功能低下，無(wú)法配合治療者；(2)除NSCLC外，合并其他惡性腫瘤、重要器官功能障礙、全身感染患者。

健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)表觀正常，自覺(jué)無(wú)身體不適；(2)年齡、性別與NSCLC術(shù)后輔助治療患者匹配；(3)肺部HRCT結(jié)果正常，無(wú)呼吸系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在精神疾病、認(rèn)知功能障礙、結(jié)締組織病、惡性腫瘤及各系統(tǒng)重大疾病者。

1.1.2 肺癌患者篩選流程

NSCLC術(shù)后輔助治療組患者血清標(biāo)本來(lái)自檢驗(yàn)科與腫瘤科共同建立的肺癌術(shù)后輔助治療患者血清標(biāo)本庫(kù)；首先從該庫(kù)中篩選肺損傷患者(肺損傷組)，隨機(jī)選取與肺損傷組患者性別、肺癌分型、TNM分期及術(shù)后輔助治療方式無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且年齡相近的無(wú)肺損傷患者為無(wú)肺損傷組。然后隨機(jī)選取性別、肺癌分型、TNM分期與肺損傷組、無(wú)肺損傷組患者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且均在術(shù)前、術(shù)后7～10 d采集靜脈血的僅手術(shù)患者為NSCLC手術(shù)組。

本研究已通過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審批(審批號(hào)：2018PS018J)。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集時(shí)間及血清KL- 6檢測(cè)

肺損傷組于肺損傷確診當(dāng)日，無(wú)肺損傷組于輔助治療第3～4個(gè)月，NSCLC手術(shù)組于術(shù)前與術(shù)后7～10 d，健康對(duì)照組于體檢當(dāng)日，采集空腹靜脈血3.0 mL，3500g離心10 min，分離血清于-70 ℃冷凍保存。采用貝克曼庫(kù)爾特AU5800全自動(dòng)生化分析儀集中進(jìn)行血清KL- 6檢測(cè)。試劑盒由日本積水醫(yī)療株式會(huì)社生產(chǎn)，購(gòu)于積水醫(yī)療科技(中國(guó))有限公司。檢測(cè)方法為膠乳凝集法。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，正常健康成人血清KL- 6的參考區(qū)間為105.3～401.2 kU/L。

1.2.2 樣本量估算及偏倚控制

本研究根據(jù)兩獨(dú)立樣本均值比較的樣本量計(jì)算公式：n1=n2=2[(uα+uβ)/(δ/σ)]2+1/4uα2，其中δ為兩總體KL- 6均數(shù)的差值；σ為總體標(biāo)準(zhǔn)差，雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，β=0.10，uα=1.96，uβ=1.28。肺損傷組、無(wú)肺損傷組總體KL- 6均值分別約為628.02、171.62 kU/L，δ=456.40，σ=362.87，δ/σ=1.3，經(jīng)計(jì)算肺損傷組和無(wú)肺損傷組所需樣本量均約為14例。NSCLC手術(shù)組、健康對(duì)照組總體KL- 6均值分別約為249.69、189.79 kU/L，δ=59.90，σ=102.25，δ/σ=0.6，經(jīng)計(jì)算NSCLC手術(shù)組和健康對(duì)照組所需樣本量均約為60例。

偏倚控制：(1)血清KL- 6檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自同一公司，使用固定的儀器按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行檢測(cè)；(2)血清KL- 6檢測(cè)人員均經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)及Q-Q圖對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料(年齡)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析；不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料(血清KL- 6)以中位數(shù)(四分位數(shù))表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評(píng)估血清KL- 6診斷NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷的效能。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共206例NSCLC患者及103例健康對(duì)照者納入本研究。其中肺損傷組51例、無(wú)肺損傷組52例(圖1)，NSCLC手術(shù)組103例。肺損傷組臨床表現(xiàn)為咳嗽23例(45.10%)、呼吸困難21例(41.18%)、發(fā)熱11例(21.57%)、無(wú)癥狀3例(5.88%)。無(wú)肺損傷組無(wú)癥狀51例(98.08%)，呼吸困難1例(1.92%)。4組性別(P=0.926)、合并結(jié)締組織病(P=0.166)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，年齡(P<0.001)、合并慢性阻塞性肺疾病(P=0.037)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；肺損傷組、無(wú)肺損傷組、NSCLC手術(shù)組病理類(lèi)型(P=0.634)、TNM分期(P=0.756)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；肺損傷組、無(wú)肺損傷組輔助治療方式(P=0.780)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

表1 患者一般資料比較

2.2 血清KL- 6比較

單因素方差分析顯示，血清KL- 6在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。進(jìn)一步組間比較顯示，血清KL- 6由高至低依次為肺損傷組[512.40(322.30，819.20)kU/L]、NSCLC手術(shù)組(術(shù)前)[204.40(162.70，283.20)kU/L]、健康對(duì)照組[177.70(154.20，206.40)kU/L]、無(wú)肺損傷組[147.80(114.25，229.80)kU/L]和NSCLC手術(shù)組(術(shù)后)[143.80(111.90，247.80)kU/L]。除無(wú)肺損傷組與NSCLC手術(shù)組(術(shù)后)血清KL- 6無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.879)外，其余兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖 1 NSCLC患者術(shù)后輔助治療性肺損傷組、無(wú)肺損傷組患者篩選流程圖

2.3 NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷診斷界值的初步建立

ROC曲線分析顯示，以無(wú)肺損傷組患者為對(duì)照，血清KL- 6診斷NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷的曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.972(95% CI：0.948～0.997)，靈敏度、特異度、陽(yáng)性似然比、陰性似然比分別為86.3%(95% CI：73.0%～94.1%)、96.2%(95% CI：86.2%～98.7%)、22.43(95% CI：5.74～87.69)、0.14(95% CI：0.07～0.28)，最佳診斷臨界值為310.15 kU/L(圖3)。

圖 2 患者血清KL- 6水平比較

圖 3 血清KL- 6診斷NSCLC患者術(shù)后輔助治療性肺損傷的ROC曲線圖

3 討論

本研究對(duì)NSCLC手術(shù)患者、NSCLC術(shù)后輔助治療患者及健康成人的血清KL- 6進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷患者的血清KL- 6顯著高于輔助治療后無(wú)肺損傷的患者、NSCLC手術(shù)患者及健康對(duì)照人群。ROC曲線分析顯示，血清KL- 6診斷NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷的AUC為0.972(95% CI：0.948～0.997)，靈敏度、特異度、陽(yáng)性似然比、陰性似然比分別為86.3%(95% CI：73.0%～94.1%)、96.2%(95% CI：86.2%～98.7%)、22.43(95% CI：5.74～87.69)、0.14(95% CI：0.07～0.28)，最佳診斷臨界值為310.15 kU/L。

肺癌患者術(shù)后輔助治療性肺損傷包括由化療引起的DILI及由放療導(dǎo)致的RILI，均屬于間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease, ILD)，主要累及肺泡壁，表現(xiàn)為Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞受損脫落，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞異常增生。影像學(xué)檢查可見(jiàn)彌漫性浸潤(rùn)陰影，肺活檢病理示彌漫性肺實(shí)質(zhì)、肺泡炎癥和間質(zhì)纖維化[10]。肺損傷患者的肺功能進(jìn)行性降低，不僅嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，且患者可因呼吸衰竭而死亡，極大程度縮短了生存期。因此，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療對(duì)提高患者的生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存時(shí)間至關(guān)重要。目前，臨床尚缺乏間質(zhì)性肺損傷診斷的血清學(xué)標(biāo)志物，HRCT是DILI、RILI診斷及病情監(jiān)測(cè)的常用手段，但部分疾病如結(jié)核分枝桿菌感染、肺癌等，肺部HRCT表現(xiàn)與DILI、RILI影像學(xué)改變類(lèi)似，單純依據(jù)HRCT易誤診；另一方面，HRCT具有輻射性，不適于NSCLC患者短期內(nèi)病情的連續(xù)監(jiān)測(cè)。因此，探究來(lái)源于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的血清生物標(biāo)志物在NSCLC患者術(shù)后輔助治療性肺損傷診斷中的應(yīng)用價(jià)值具有重要作用。KL- 6是一種主要在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)的高分子量黏液糖蛋白，DILI、RILI時(shí)肺泡基底膜受損，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞為修復(fù)損傷而增生，導(dǎo)致KL- 6生成增多并通過(guò)受損的基底膜進(jìn)入血液。因此，血清KL- 6作為間質(zhì)性肺損傷的特異性標(biāo)志物，在各種以Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生為特征的ILD如IPF、膠原血管病相關(guān)間質(zhì)性肺炎、超敏性肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺結(jié)節(jié)[7]及嚴(yán)重急性呼吸綜合征所致肺損傷[11- 13]的診斷、病情嚴(yán)重程度評(píng)估及治療效果監(jiān)測(cè)中具有重要價(jià)值。另有研究報(bào)道，血清KL- 6是預(yù)測(cè)依維莫司致肺損傷的生物標(biāo)志物[3]，亦可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)放射性肺炎的發(fā)生及評(píng)估治療療效[14- 15]。對(duì)于RILI、DILI，既往研究認(rèn)為血清KL- 6是可靠的血清生物標(biāo)志物之一，但其研究對(duì)象主要為日本人群[7]，目前缺乏KL- 6在中國(guó)人群NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷診斷價(jià)值的相關(guān)研究。

本研究結(jié)果顯示，肺損傷組血清KL- 6升高最為顯著，且與其他組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示血清KL- 6在NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷中具有診斷價(jià)值；進(jìn)一步以無(wú)肺損傷組為疾病對(duì)照組，通過(guò)ROC曲線評(píng)估其診斷輔助治療性肺損傷的臨床價(jià)值，結(jié)果顯示血清KL- 6診斷NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷的AUC達(dá)0.972，且靈敏度和特異度均較高，提示其具有較高的診斷效能，與既往報(bào)道的血清KL- 6診斷ILD的靈敏度約為70%～100%相符[7]。

本研究ROC曲線分析顯示，血清KL- 6診斷NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷的最佳診斷臨界值為310.15 kU/L，該診斷臨界值在本研究所使用試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的正常參考區(qū)間范圍內(nèi)。既往文獻(xiàn)報(bào)道，血清KL- 6表達(dá)水平存在種族差異[7]。本研究所使用的血清KL- 6檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的參考區(qū)間來(lái)源于日本人群，是否適用于中國(guó)人群尚未可知。為減少偏倚、使結(jié)果更客觀，本研究團(tuán)隊(duì)基于納入的健康對(duì)照人群數(shù)據(jù)，初步建立中國(guó)東北地區(qū)50歲以上健康成人的血清KL- 6參考區(qū)間為112.90 ～311.52 kU/L，其上限值顯著低于試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的參考區(qū)間上限值，且與本研究確定的最佳診斷臨界值310.15 kU/L基本一致。

有文獻(xiàn)報(bào)道，KL- 6在肺癌細(xì)胞中高度表達(dá)，其在肺癌患者中的陽(yáng)性率約為30%～70%[5,16- 19]。本研究NSCLC手術(shù)組(術(shù)前)血清KL- 6水平高于健康對(duì)照組，與KL- 6在肺癌中的高表達(dá)有關(guān)；生理情況下，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、細(xì)支氣管上皮細(xì)胞是KL- 6的主要產(chǎn)生部位，NSCLC手術(shù)組(術(shù)后)與NSCLC術(shù)后輔助治療無(wú)肺損傷組患者的血清KL- 6水平顯著低于健康對(duì)照組，可能與其肺葉切除有關(guān)。

研究的局限性：(1)本研究為單中心、單因素回顧性研究，入選病例均為T(mén)NM分期Ⅱ～Ⅲ期的NSCLC患者，需擴(kuò)大肺癌人群進(jìn)一步探討。(2)肺損傷患者的HRCT表現(xiàn)較一致，嚴(yán)重肺纖維化的患者較少，無(wú)法探究血清KL- 6與肺損傷嚴(yán)重程度的關(guān)系。(3)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，ILD發(fā)病后患者血清KL- 6水平與基線(治療開(kāi)始)的比值可預(yù)測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑治療的晚期NSCLC患者預(yù)后[20]。本研究未對(duì)患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，無(wú)法判斷血清KL- 6在NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷患者預(yù)后預(yù)測(cè)中的作用。

綜上，NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷患者血清KL- 6顯著升高，其在NSCLC術(shù)后輔助治療性肺損傷診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，但仍需大樣本前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)：吳麗娜、秦曉松負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫(xiě)；高弋、李沃松負(fù)責(zé)標(biāo)本留取及臨床資料收集；劉勇指導(dǎo)研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及修改論文。

利益沖突：無(wú)