液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在罕見病診斷中的臨床應(yīng)用

禹松林，王丹晨，鄒雨桐，馬曉麗，邱 玲

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科 疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，北京 100730

近年來，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)技術(shù)在臨床檢驗領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。其因特異度高、可同時區(qū)分/定量多種代謝物等特點，正逐漸從科研應(yīng)用走向臨床實踐前沿。一方面，在目前常規(guī)生化免疫學(xué)尚無成熟檢測方法的情況下，LC-MS/MS技術(shù)可作為臨床亟需項目的重要補(bǔ)充；另一方面，作為鑒別檢測干擾物的利器，LC-MS/MS技術(shù)可標(biāo)化不同分析系統(tǒng)檢驗結(jié)果的一致性，對同一待測物質(zhì)不同結(jié)構(gòu)亞組進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，從而在臨床精準(zhǔn)診斷中發(fā)揮越來越大的作用。罕見病患者僅占全球人口的0.65‰～1‰，但病種多達(dá)7000多種，且臨床表現(xiàn)差異大，診斷非常困難。為加強(qiáng)我國罕見病防治管理、提高罕見病診療水平，2018年國家衛(wèi)生健康委員會聯(lián)合五部門制定了《第一批罕見病目錄》，納入了121種罕見病。目前罕見病體外診斷領(lǐng)域的主要關(guān)注點集中于基因突變檢測方面，而對具有篩查、診斷及鑒別診斷作用的代謝物、激素等的定量檢測則缺乏完整的解決方案。LC-MS/MS技術(shù)具有同時準(zhǔn)確定量分析多種物質(zhì)的能力，可以對罕見病的早期診斷及治療監(jiān)測提供有力的實驗室?guī)椭Ｄ壳埃琇C-MS/MS技術(shù)已在多種罕見病檢測中發(fā)揮關(guān)鍵作用，本文參考我國《第一批罕見病目錄》，同時納入部分不在此目錄但北京協(xié)和醫(yī)院接診較多且患病率低于1/10 000的疾病，分析LC-MS/MS技術(shù)在其診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景。

1 激素相關(guān)罕見病

目前，睪酮、雌二醇等激素已有相對成熟的免疫學(xué)檢測方法，但免疫學(xué)方法可檢測的激素項目有限，且不同免疫平臺的檢測結(jié)果差異較大。遇到非特異性干擾時，檢測結(jié)果可能給臨床診斷帶來困擾，甚至有學(xué)者指出，“采用免疫學(xué)方法檢測睪酮還不如猜一個結(jié)果更加準(zhǔn)確”[1]。而LC-MS/MS方法特異度高，在激素檢測中具有巨大優(yōu)勢。

1.1 類固醇激素相關(guān)罕見病

類固醇激素種類眾多，代謝通路復(fù)雜，與多種腎上腺及性腺疾病相關(guān)。目前基于LC-MS/MS技術(shù)可同時檢測幾十種類固醇激素，在一系列類固醇激素相關(guān)罕見病如先天性腎上腺皮質(zhì)增生性疾病及其亞型的診斷和鑒別診斷中發(fā)揮著重要作用。21-羥化酶缺乏導(dǎo)致的先天性腎上腺皮質(zhì)增生(congenital adrenal hyperplasia, CAH)的臨床實踐指南明確指出，免疫學(xué)方法測定17α-羥孕酮存在假陽性結(jié)果，推薦采用LC-MS/MS作為首選測定方法，以改進(jìn)CAH的陽性預(yù)測結(jié)果[2]。CAH亞型種類較多，包括11β-羥化酶缺陷癥、17-羥化酶缺陷癥、21-羥化酶缺陷癥、3β-羥基類固醇脫氫酶缺陷癥等。此外，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，不同亞型激素的升高或降低不完全相同，例如，21-羥化酶缺陷癥導(dǎo)致的CAH表現(xiàn)為11-脫氧皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮等鹽皮質(zhì)激素降低，17α-羥孕酮、孕酮、睪酮增高；而11β-羥化酶缺陷癥表現(xiàn)為11-脫氧皮質(zhì)醇增高，皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮降低；3β-類固醇脫氫酶缺陷癥則表現(xiàn)為17α-羥孕烯醇酮和脫氫表雄酮增高，孕酮、17α-羥孕酮、雄烯二酮降低。CAH亞型的臨床診斷及鑒別診斷困難，往往需依賴多種類固醇激素的聯(lián)合檢測。目前，對于11-脫氧皮質(zhì)醇、17α-羥孕烯醇酮等激素的檢測尚無成熟的生化免疫學(xué)方法，而LC-MS/MS技術(shù)為多種類固醇激素同時、準(zhǔn)確檢測提供了可能。近年來，國內(nèi)外相繼開發(fā)出可同時檢測10種以上類固醇激素的LC-MS/MS方法，為CAH亞型的診斷及鑒別診斷提供了幫助[3- 4]。

北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科建立的同時測定25種類固醇激素的方法，在既往報道的20種類固醇激素[4]的基礎(chǔ)上，增加了18-氧皮質(zhì)醇、18-羥皮質(zhì)醇、18-羥皮質(zhì)酮等指標(biāo)，與醛固酮的聯(lián)合應(yīng)用對于原發(fā)性醛固酮增多癥及其亞型、醛固酮分泌瘤及雙側(cè)腎上腺增粗具有鑒別意義[5]。然而，基于LC-MS/MS技術(shù)獲得的眾多類固醇激素的檢測結(jié)果也為檢驗科及初級臨床醫(yī)生對于結(jié)果的準(zhǔn)確判讀提出了挑戰(zhàn)。基于此，北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科根據(jù)25種類固醇激素的代謝途徑，制定了以代謝通路為模板的檢驗報告(圖1)。

圖 1 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科類固醇激素檢驗報告模板

1.2 兒茶酚胺激素相關(guān)罕見病

兒茶酚胺(catecholamine, CA)包括多巴胺(dopamine, DA)、腎上腺素(epinephrine, E)和去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)，又可分別代謝為3-甲氧基酪胺(3-methoxytyramine, 3-MT)、3-甲氧基腎上腺素(metanephrine, MN)、3-甲氧基去甲腎上腺素(normetanephrine, NMN)等。CA及其代謝物的檢測在嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(pheochromocytomas and paragangliomas，PPGLs)的篩查、診斷及治療監(jiān)測中起著決定性作用。PPGLs起源于腎上腺及腎上腺外的嗜鉻細(xì)胞，發(fā)病率較低，約占高血壓患者的0.1%～0.6%。國內(nèi)外多個關(guān)于PPGLs的診療指南[6- 7]均指出，PPGLs診斷首選的生化指標(biāo)為血游離或尿分餾MN和NMN， NE、E和DA可協(xié)助診斷，并推薦采用LC-MS/MS或液相色譜串聯(lián)電化學(xué)檢測器進(jìn)行檢測。多個研究數(shù)據(jù)顯示，血游離MN和NMN的檢測結(jié)果對PPGLs的診斷靈敏度及特異度均達(dá)90%以上，而尿CA的診斷靈敏度(69%～92%)和特異度(72%～96%)較代謝物MN和NMN稍低[6- 7]，且CA更易受患者情緒(應(yīng)激/焦慮)、活動(運(yùn)動)以及飲食(酒精/咖啡)等影響。盡管LC-MS/MS技術(shù)測定CA及其代謝物優(yōu)勢明顯，但為保證結(jié)果的可靠性，需嚴(yán)格控制影響因素，如藥物、樣本采集后的放置條件等[8- 10]。

2 遺傳性代謝障礙相關(guān)罕見病

新生兒遺傳性代謝障礙多為罕見病，其患病率約為16.25/10 000，主要包括氨基酸代謝病(如苯丙酮尿癥、高苯丙氨酸血癥)、有機(jī)酸代謝病(如丙酸血癥、戊二酸血癥)和脂肪酸代謝病(如原發(fā)性肉堿缺乏癥)等[11]。串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry，TMS)技術(shù)是其首選測定方法[12]。基于TMS技術(shù)，通過幾滴血、一次檢測便可在幾分鐘內(nèi)測定幾十種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮等化合物，滿足對多種新生兒遺傳性代謝障礙同時篩查的需求。歐美等發(fā)達(dá)國家已將其列為法定篩查項目，在我國部分大中城市也已相繼開展[13]。然而，TMS技術(shù)不經(jīng)過色譜分離，無法區(qū)分同分異構(gòu)體，同時存在其他代謝物干擾的風(fēng)險，因此在一些特殊情形下，對TMS技術(shù)檢測陽性的樣本采用LC-MS/MS或氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography-tandem mass spectrometry, GC-MS/MS)技術(shù)進(jìn)行二次篩查具有重要意義。

甲基丙二酸血癥(methylmalonic acidemia，MMA)作為一種嚴(yán)重異質(zhì)性丙二酸甲酯和鈷胺素(維生素B12)代謝性疾病，可造成多臟器(肝臟、腎臟等)損害，致死率較高且存活者預(yù)后不良[14- 15]。MMA在中國較為常見，由于其臨床異質(zhì)性大，易造成漏診或誤診[16]。因此，早期診斷、治療至關(guān)重要。基于TMS技術(shù)測定干血斑中肉堿水平是臨床提示MMA的重要指標(biāo)，然而該方法缺乏特異性，陽性預(yù)測值較低，很難實現(xiàn)與丙酸血癥等的準(zhǔn)確鑒別診斷。因此，推薦對新篩陽性樣本進(jìn)一步采用LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行二次篩查[17]。盡管采用免疫學(xué)方法可實現(xiàn)維生素B12的測定，但其易受內(nèi)因子抗體干擾而出現(xiàn)測定結(jié)果假性正常或增高的現(xiàn)象[18]。基于LC-MS/MS技術(shù)不僅可實現(xiàn)維生素B12、甲基丙二酸的準(zhǔn)確測定，亦可與其代謝產(chǎn)物琥珀酸相區(qū)分，從而有效降低MMA篩查的假陽性率，且該方法無需衍生化步驟，相比GC-MS/MS技術(shù)操作更簡單、快速[15]。

基于LC-MS/MS技術(shù)可同時準(zhǔn)確定量多種脂肪酸，對X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(X-linked adrenoleukodystrophy，X-ALD)等罕見病的輔助診斷具有重要價值。X-ALD由于ABCD1基因突變、過氧化物酶體代謝極長鏈脂肪酸障礙，導(dǎo)致極長鏈脂肪酸在腎上腺、腦白質(zhì)等部位蓄積，進(jìn)而影響腎上腺和腦白質(zhì)功能，其在男性中的發(fā)病率約為1/21 000。由于本病尚無有效的治療手段，攜帶者的檢出和產(chǎn)前診斷意義重大。常見的極長鏈脂肪酸包括C22∶0、C24∶0和C26∶0，研究顯示基于TMS技術(shù)評估干血斑中極長鏈脂肪酸，特別是C26∶0與C22∶0的比值可快速、簡便、可靠地篩查X-ALD及其他過氧化物酶體疾病[19]，而基于LC-MS/MS技術(shù)準(zhǔn)確定量血漿中的C26∶0和C24∶0，可作為進(jìn)一步診斷的方法，其鑒別X-ALD的特異度可達(dá)100%[20]，此外，基于LC-MS/MS技術(shù)可同時檢測羊水和血液中C22∶0、C24∶0、C26∶0等的水平，檢測性能良好、無需衍生化[21]。

基于LC-MS/MS技術(shù)可快速準(zhǔn)確測定體液中氨基酸、脂肪酸、有機(jī)酸及肉堿等代謝物質(zhì)的水平，輔助相關(guān)疾病篩查，降低TMS技術(shù)初篩的假陽性率。但值得注意的是，氨基酸、脂肪酸及有機(jī)酸等代謝相關(guān)的罕見病多為遺傳性疾病，質(zhì)譜方法大多僅可作為篩查、輔助診斷及治療監(jiān)測的手段，最終的確診和鑒別診斷仍依賴于酶活性測定和/或基因檢測。

3 維生素代謝相關(guān)罕見病

據(jù)文獻(xiàn)報道，低磷性佝僂病這一罕見病患者表現(xiàn)為25OHD3正常或稍低，1,25(OH)2D3則由于1α-羥化酶受到成纖維細(xì)胞生長因子抑制而明顯降低[22- 23]。在CYP24A1突變導(dǎo)致的特發(fā)性高鈣血癥患者中，25OHD失活途徑受阻，導(dǎo)致無法代謝生成24,25(OH)2D，體內(nèi)24,25(OH)2D含量明顯降低。2016年Ketha等[24]指出25OHD與24,25(OH)2D的比值可作為篩查CYP24A1突變的常規(guī)臨床檢查指標(biāo)，并建議對臨床不明原因的高鈣血癥患者，采用LC-MS/MS檢測25OHD與24,25(OH)2D的比值以篩查CYP24A1突變[24]。目前免疫學(xué)方法可測定25OHD以及1,25(OH)2D3，但傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測方法易受非特異性交叉干擾，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確[25]，且免疫學(xué)方法存在無法區(qū)分維生素D2和D3亞型，測定范圍較窄等問題。而LC-MS/MS具有特異度好的優(yōu)勢，可同時分析維生素D及其代謝物等多種亞組成分[26- 27]，因此其在需對維生素D及其代謝物進(jìn)行區(qū)分的維生素D代謝相關(guān)罕見病中日漸受到臨床認(rèn)可。北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科亦于2018年率先在國內(nèi)建立了LC-MS/MS同時測定25OHD和24,25(OH)2D的方法[25]， 在CYP24A1突變導(dǎo)致的特發(fā)性高鈣血癥、低磷性佝僂病等的篩查及治療監(jiān)測中發(fā)揮了重要作用。

4 IgG4相關(guān)性疾病

近年新命名的IgG4相關(guān)性疾病(IgG4 related disease，IgG4-RD)是一類原因不明的慢性、進(jìn)行性炎癥伴纖維化和硬化的疾病，主要特征為血清IgG4水平顯著增高。研究顯示，血清IgG4濃度診斷IgG4-RD的靈敏度和特異度分別為87.2%和82.6%[28]，但其采用不同方法測定具有不同的臨界值，通常采用的定量方法是自動免疫比濁法。盡管免疫比濁法應(yīng)用廣泛，但存在校準(zhǔn)差異[29- 31]和抗原過量干擾(“鉤”效應(yīng))[32- 33]等局限性。采用LC-MS/MS可在一次進(jìn)樣中完成對4種IgG亞型及IgG總量共5個指標(biāo)的同時測定，且IgG亞型的加和值和直接測得的IgG總量的相關(guān)性優(yōu)于免疫比濁法[34]。有研究分別采用免疫比濁法和LC-MS/MS對75例患者樣本的IgG亞型進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)兩種方法的結(jié)果并不一致，IgG2抗體與IgG4抗體存在交叉干擾，導(dǎo)致免疫比濁法分開測定4種亞型IgG的加和值高于直接測得的IgG總值，而采用LC-MS/MS測得的各亞型的加和值與總值接近(70例結(jié)果偏差在20%以內(nèi))[35]。

5 帕金森病

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)雖被界定為罕見病，但隨著中國老齡化進(jìn)程加速，PD作為除阿爾茨海默病外最常見的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率越來越高，目前僅可通過臨床癥狀診斷，并無明確的生物學(xué)指標(biāo)。有研究采用代謝組學(xué)手段，利用高分辨質(zhì)譜技術(shù)準(zhǔn)確定性的能力對可能的PD生物標(biāo)志物進(jìn)行了探索，并發(fā)現(xiàn)N1,N8 -二乙酰亞胺可能是診斷PD的生物標(biāo)志物[36]。此外，有報道稱嘌呤代謝物是PD惡化或改善的臨床相關(guān)生物標(biāo)志物，而基于LC-MS/MS技術(shù)可實現(xiàn)6種嘌呤分子的同時測定[37]。未來，LC-MS/MS技術(shù)有望在PD診治中發(fā)揮重要作用。

6 前景與挑戰(zhàn)

隨著LC-MS/MS技術(shù)的不斷進(jìn)步，其臨床應(yīng)用越來越廣泛，并在CAH、PPGLs、MMA、X-ALD等多種罕見病的篩查、診斷、鑒別診斷以及治療監(jiān)測中嶄露頭角。然而，LC-MS/MS技術(shù)在推廣應(yīng)用過程中仍存在較大挑戰(zhàn)：首先，LC-MS/MS技術(shù)目前尚存在自動化程度低、儀器昂貴、配套試劑和質(zhì)控品不成熟等問題，造成實驗室人員工作量較大；其次，罕見病指標(biāo)繁多，國內(nèi)研究較少，缺乏基于LC-MS/MS檢測方法的國內(nèi)人群參考區(qū)間，特別是對于受到月經(jīng)周期、年齡、性別等影響的指標(biāo)，建立其人群參考區(qū)間面臨巨大挑戰(zhàn)；此外，某些臨床有需求的項目尚未建立收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)，致使工作進(jìn)一步開展受到限制。然而，隨著國家對罕見病關(guān)注度的提高以及國內(nèi)外醫(yī)療器械生產(chǎn)廠商、醫(yī)療應(yīng)用機(jī)構(gòu)對LC-MS/MS技術(shù)的不斷研發(fā)，目前存在的問題正在逐步被解決。總之，LC-MS/MS技術(shù)在臨床檢測領(lǐng)域已展現(xiàn)出強(qiáng)大優(yōu)勢，不僅可與現(xiàn)有生化免疫技術(shù)實現(xiàn)互補(bǔ)，未來在發(fā)現(xiàn)及驗證罕見病新的生物標(biāo)志物方面亦將發(fā)揮不可估量的作用。

作者貢獻(xiàn)：禹松林負(fù)責(zé)整理文獻(xiàn)、撰寫論文；王丹晨、鄒雨桐、馬曉麗負(fù)責(zé)文獻(xiàn)查閱與收集；邱玲負(fù)責(zé)修訂、審核論文。

利益沖突：無