臨床微生物快速檢測新技術發展現狀與前景

寧雅婷，楊啟文，陳新飛，郁謹菡，李 雪,3，徐英春

1中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院檢驗科 疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，北京 100730 2中國醫學科學院 北京協和醫學院研究生院， 北京 100005 3首都醫科大學附屬北京安貞醫院檢驗科，北京 100029

感染性疾病尤其是血流感染，起病急、進展快，延遲治療、療程不足或不當的抗感染治療常與患者不良預后密切相關[1]。盡管在感染24 h內采用經驗性治療可改善患者預后，但普遍、大量使用抗菌藥物已導致耐藥菌激增，甚至暴發。早期精準識別病原體，對患者預后及抑制病原體耐藥至關重要[2]。病原體鑒定和體外藥物敏感性檢測是臨床微生物實驗室最重要的職能，但常規檢測方法耗時均較長，快速檢測新技術已成為檢驗與臨床關注的焦點。本文圍繞病原微生物快速鑒定及藥物敏感性檢測的最新技術展開討論，以期為臨床微生物實驗室未來發展提供參考。

1 新型快速鑒定或直接樣本檢測技術

微生物鑒定是病原診斷的基礎，盡早獲得病原體的種或屬，可為臨床感染性疾病早期有針對性地采用恰當治療方案提供重要依據。傳統方法為分離培養和鏡檢，對檢驗人員的經驗性技能要求高，且報告時間長。隨著生物技術的發展，新型快速鑒定技術不斷涌現。

1.1 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)利用激光照射蛋白和基質的共結晶體使細菌等病原體核糖體蛋白離子化，在電場中按離子質荷比分離后可獲得該病原的蛋白圖譜，將其與參考圖譜比對進行鑒定。目前該技術對分純后單菌落的鑒定已非常成熟，對常見病原細菌或酵母菌的鑒定準確率高達95%，但對苛養、厭氧菌等難培養菌的鑒定準確率稍低(75%～90%)，尤其對非脆弱類桿菌的鑒定誤差較大[3- 4]。絲狀真菌由于細胞壁復雜且現有數據庫菌種涵蓋范圍有限，采用MALDI-TOF MS鑒定效果較差。研究表明，MALDI-TOF MS對曲霉種水平的鑒定準確率可達95%，而對非曲霉絲狀真菌的鑒定準確率僅為57.7%[5- 6]。此外，MALDI-TOF MS對臨床罕見病原的鑒定效果較好，聯合16S rRNA測序補充鑒定，細菌鑒定準確率可達95.4%[7]; 聯合核糖體DNA測序，酵母菌鑒定準確率高達99%[8]。直接樣本鑒定方面，目前MALDI-TOF MS對血培養陽性樣本的直接鑒定較為成熟，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌屬水平鑒定準確率分別為80.5%和90.2%，種水平為60.5%和72.3%，可顯著提高菌血癥患者24 h內接受最佳抗菌藥物的治療率[9]；值得注意的是，低載菌量的腦脊液、尿液和胸腹腔積液需先短期培養或富集，再行MALDI-TOF MS快速鑒定[10]。

當然，MALDI-TOF MS目前仍存在諸如對于混合菌的鑒定準確率不高、近親緣關系菌種分辨率不高、直接鑒定所需菌量較高等問題，未來隨著菌種圖譜的積累和樣本前處理的優化，其有望逐步取代傳統的生化編碼鑒定方法。

1.2 光譜技術

光譜技術基于微生物的光譜特征，可明確其結構和組成。與傳統微生物技術相比，光譜技術具有高特異度、高分辨率、對微生物無損傷且操作簡便等獨特優勢。目前應用于臨床微生物領域的光譜技術主要有拉曼光譜、近紅外光譜、高光譜圖像和激光誘導擊穿光譜，具體原理及應用見表1。

1.3 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器由識別元件、病原體核酸靶標、次級識別元件構成，通過標記信號分子如熒光基團產生電信號以鑒定微生物，且信號強弱與病原體含量呈正比。與傳統PCR核酸檢測方法相比，該技術具有便攜性、快速性、簡便性和低成本的優勢，可直接應用于樣本，無需復雜的樣本前處理，對環境要求不高，普通實驗室環境即可操作。該技術可直接鑒定原始樣本中的病原體，使細菌鑒定時間縮短至1 h內；且可在3.5 h內獲得多種抗菌藥物的藥物敏感性檢測結果，既保留了表型分析的真實性，又兼具分子檢測的敏感性和特異性[20- 21]。目前該技術已應用于尿路感染的病原學診斷，實現了電化學與微流控技術的集成，適用于多種病原體快速菌種鑒定聯合藥物敏感性檢測等臨床需求[22]。未來研究重點應是突破批量樣本檢測的瓶頸，達到自動化上樣分析，并將藥物敏感性檢測與結果分析整合，實現“單芯片實驗室”運行模式。

表 1 不同光譜技術原理及其在臨床微生物檢測領域的應用

1.4 綜合性分子診斷平臺

綜合性分子診斷平臺是以PCR技術為基礎，樣本處理、核酸檢測及分析一體化的“樣本進、結果出”高度自動化病原診斷平臺，如GeneXpert和Film-Array等已成熟應用于臨床微生物實驗室。GeneXpert是直接針對樣本中的某種病原體的快速鑒定及耐藥性檢測平臺，以實時定量熒光PCR作為檢測技術，采用模塊化配置，使用靈活。目前主要用于金黃色葡萄球菌、產毒型肺炎克雷伯菌、結核分枝桿菌、新型冠狀病毒和流感病毒等的篩查鑒定，以及甲氧西林、碳青霉烯類和利福平耐藥菌等的檢測[23- 27]。FilmArray采用巢氏多重PCR技術，從疾病角度設計檢測病原組，可實現對導致相似臨床癥狀的多種致病菌的同步靶向檢測；根據感染源可分為針對上呼吸道、血流、胃腸道和腦脊液標本的多種試劑盒[28]。綜合性分子診斷平臺基本可實現1 h報告結果，特異度及靈敏度高，操作簡單安全，所有提取、擴增和檢測步驟均在芯片的不同通道中完成，最大程度減少了污染的發生，同時保證操作人員的安全性。隨著整體成本下調，其在臨床常規工作中必將獲得廣泛應用。

1.5 宏基因組測序

宏基因組測序(metagenomics sequencing，mNGS)無須培養，直接抽提感染標本中病原體核酸進行高通量測序，通過基因組比對分析，確定標本中微生物的種屬和定量。mNGS可全面覆蓋上萬種微生物，無偏向性快速鑒定細菌、真菌和病毒等多種病原微生物[29- 30]。此外，mNGS在罕見病原體診斷和新發未知病原體檢測、溯源與變異監控方面也發揮重要作用，如曼氏裂頭蚴、新型冠狀病毒的發現[31- 32]。mNGS亦對耐藥及毒力基因分析進行了探索，但受技術本身影響(測序深度不夠)，可能會漏檢臨床標本中低濃度微生物，故目前對耐藥及毒力基因分析仍較難實現。未來可優化方法去除人源宿主核酸以提升微生物基因組比例，或靶向捕獲富集。

2021年，國家衛生健康委員會臨床檢測中心啟動了下呼吸道宏基因組學檢測室間質評研究，mNGS正在走向規范化與全流程自動化。此外，未來將通過mNGS與宏轉錄組學、隨機測序與靶向測序技術聯用，實現病原體鑒定分型與相對定量、耐藥基因與毒力因子分析以及宿主轉錄組學與免疫應答分析，從病原、藥物和宿主3個維度進行病原檢測與感染診斷[33]。

2 新型快速藥物敏感性檢測技術

微生物具有高度異質性，同時生態環境壓力、藥物選擇壓力和宿主免疫壓力加速了菌株變異，目前耐藥性發展的速度已遠超新藥研制速度[34]。而常規檢測方法，如紙片擴散法、濃度梯度稀釋法和肉湯稀釋法，耗時均較長(至少18 h)，亟需快速藥物敏感性檢測技術，以減少抗菌藥物經驗性治療期，遏制耐藥發生。目前已有的快速藥物敏感性檢測技術依據檢測原理可分為以表型為基礎和以基因型為基礎兩類。

2.1 新型表型藥物敏感性檢測技術

由于微生物表型變化迅速，新型表型藥物敏感性檢測技術側重以檢測抗菌藥物作用下病原菌生長阻滯情況作為指標，以判斷耐藥性或檢測藥物敏感性[35]。主要檢測指標包括：(1)藥物孵育后細胞定量，可通過電阻抗細胞計數法、電化學傳感器核酸定量檢測法[21]進行。(2)通過相差/熒光顯微鏡觀察生長情況，可通過微生物表面熒光標記——96孔板讀孔裝置檢測，實現5 h獲得藥物敏感性檢測結果[36]。(3)檢測病原體死亡比例，可通過特異性染色后流式分析計數。(4)檢測代謝產物活性或底物表征生長狀況，例如pH 顯色傳感器可檢測葡萄糖代謝產酸，實現2 h內檢測腸桿菌對多黏菌素的耐藥性[37]；重水同位素標記-拉曼光譜系統，可檢測細胞脂質合成過程中氘峰替換率，反映代謝活性[15]。

該類方法可直接觀察細菌在體外對抗菌藥物的敏感和耐受情況，是在傳統藥物敏感性檢測基礎上充分開發的結果。在基因型藥物敏感性檢測技術未完善和明確定論前，這種“中間技術”的可行性較大，臨床實施時間更早，但與基因型檢測技術相比，檢測速度受限。限制該類方法應用的主要問題為檢測所需樣本菌量較高，降低接種量或從低菌量樣本中純化的技術仍是藥物敏感性檢測技術發展中的巨大挑戰。

2.2 新型基因型藥物敏感性檢測技術

新型基因型藥物敏感性檢測技術是直接從臨床樣本中檢測與耐藥性相關的基因表達量或突變情況，其對生長緩慢(如真菌)或難培養的病原體具有重要價值。目前新型基因型藥物敏感性檢測技術仍以PCR或核酸探針矩陣為基礎，對反應體系和條件進行優化，以提高檢測速率和通量，如錯配擴增突變分析PCR、高分辨率溶解度實驗等[34]。該類方法檢測時間短，可定量分析，并可明確耐藥機制，但仍存在諸如由于遺傳異質性大、耐藥機制復雜多樣導致的臨床工作龐雜等普遍性問題。此外，新型基因型藥物敏感性檢測技術尚不能用于臨床迫切需求的新型耐藥菌檢測。目前，新型基因型藥物敏感性檢測技術尚未在臨床實踐中普及應用，該技術仍需進一步臨床觀察及標準化。

3 小結與展望

隨著醫療環境的改善和生物技術的飛速發展，快速精準診療已成為臨床關注的重點。實際臨床應用中，新型微生物快速檢測技術需在保證靈敏度和特異度的情況下最大程度縮短周轉時間，同時具備低成本、操作簡單和高通量等特點。未來需從以下3個方面實現突破：(1)突破檢測上樣菌量局限，擴大“直接從樣本中進行檢測”的適用樣本范圍，并提高檢測準確率，節約分離培養的時間；(2)聯合表型和基因型藥物敏感性檢測技術，實現無偏倚檢測，在快速測定最小抑菌濃度藥物敏感性檢測值的同時，明確其耐藥機制，為今后靶向藥物開發與研究提供臨床信息基礎；(3)實現同一儀器、一步加樣即可完成鑒定及耐藥性檢測。目前眾多新型微生物檢測技術仍處于火熱的研發和評估階段，僅MALDI-TOF MS技術成熟穩定。因此，投入較少的時間對現有技術進行快速科研優化與應用改進，使之盡早獲得臨床認可是首要任務，以便具有優異性能特征的新技術能夠快速上市。

作者貢獻：寧雅婷負責撰寫、修訂文章；楊啟文、陳新飛、郁謹菡、李雪負責收集并整理文獻；徐英春負責審校文章。

利益沖突：無

志謝：感謝廣州微遠基因科技有限公司李永軍，捷儀科技(北京)有限公司陸宜，山東鑫科生物科技股份有限公司崔璟、張會翠對本文的建議與指導。